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.1997年3月24日；136(6):1349-61.
doi:10.1083/jcb.136.6.1349。

缺乏紧张素的小鼠进行性肾脏变性

S H低 1, Q C于, L德根斯坦, L B陈, E富克斯
附属公司

缺乏紧张素的小鼠进行性肾脏变性

S H低等。 J细胞生物学. .

摘要

张力蛋白是一种与F-actin结合的局灶性粘附磷酸蛋白，包含一个功能性Src同源2结构域。为了探索紧张素的生物学功能，我们克隆了小鼠紧张素基因，确定了其表达程序，并利用基因靶向产生缺乏紧张素的小鼠。尽管在胚胎发生期间，张力蛋白在许多不同组织中表达，但张力蛋白缺失小鼠发育正常，出生后至少几个月内看起来很健康。随着时间的推移，-/-小鼠由于肾脏的异常而变得虚弱，肾脏是一个表达高水平紧张素的器官。有明显虚弱迹象的小鼠表现出肾功能衰竭的迹象，近端肾小管中有多个大囊肿，但即使在血液分析正常的张力蛋白阴性小鼠中，囊肿也普遍存在。在超微结构上，非囊性区域显示出典型的细胞-基质连接，很容易被针对其他局部粘附分子的抗体标记。在异常区域，细胞-基质连接被破坏，小管细胞缺乏极性。综上所述，我们的数据表明，在肾脏中，张力蛋白的丢失会导致局部粘连的减弱，而不是破坏。所有其他组织均正常，这表明，在大多数情况下，张力蛋白的各种功能是多余的，可能会被其他局部粘附蛋白所补偿。

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数字

图1
图1
小鼠胚胎发育过程中张力蛋白mRNA的表达。从妊娠第7、11、15和17天的小鼠胚胎中分离的mRNA的Northern blot与对应于张力蛋白、p130cas和β-肌动蛋白的放射性标记cDNA探针杂交（正常化对照；E15和E17样品中出现的较小条带对应于骨骼肌肌动蛋白mRNA的预期大小）。条形代表9.5 kb和7.5 kb RNA分子标准的迁移。
图2
图2
E10小鼠胚胎中张力蛋白mRNA的表达。将E10小鼠胚胎的矢状石蜡切片（5μm）与1200核苷酸、地高辛标记的反义张力蛋白cRNA探针杂交(一个). 相应的sense-strend探针未检测到杂交(B类).MB（MB）中脑壁；NP公司，鼻突；文学士鳃弓；H（H），心脏；卢，肺；C类，椎体；克中肠；锂，肝脏。棒材，420μm。
图3
图3
成人组织中张力蛋白mRNA的表达。将所示成年小鼠组织中mRNA的Northern印迹与对应于张力蛋白和β-肌动蛋白的放射性标记cDNA探针依次杂交。条形代表9.5、7.5、2.4和1.4 kb RNA分子标准的迁移。
图4
图4
胚胎干细胞和小鼠中张力蛋白基因的破坏。(一个)靶向载体和紧张素基因座的同源重组。所示为小鼠紧张素基因部分的部分限制性内切酶图谱。(打开箱子)用于靶向的5′和3′侧翼序列；(黑匣子)用于Southern blot分析的5′和3′基因组DNA探针；(PGK-新和PGK-TK公司)在磷酸甘油激酶1启动子的控制下，新霉素抗性和疱疹胸苷激酶基因分别用于阳性和阴性选择。B类巴米希；E类、EcoRI；服务提供商，SpeI；S公司、SacI；X（X），XhoI。(B类)从+/+、+/-和−/−小鼠尾部分离的DNA的Southern blot分析。用限制性内切酶EcoRI消化小鼠尾部DNA(左边)或BamHI(中间的和正确的)经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离。转移到硝酸纤维素纸上后，将印迹与放射性标记的cDNA探针杂交，该探针对应于图中所示的5′和3′片段一个，并发送至PGK-新基因（5′EcoRI–BamHI片段）如图所示。(星号)预期成功同源重组事件的条带（2.8 kb，5′探针；0.4 kb，3′探针）；(箭头)野生型基因组预期带（4kb，5′探针；6.8kb，3′探针）；(箭头)新霉素探针带（3.8kb）。(C类)来自+/+、+/-和−/−15-d小鼠胚胎的成纤维细胞中张力蛋白的免疫印迹分析。从15天小鼠胚胎的皮肤培养成纤维细胞。全细胞裂解物（30μg）通过7%聚丙烯酰胺SDS凝胶进行电泳，然后转移至硝化纤维素。在用Ponceau S染色以确认蛋白质负载相等（未显示）后，印迹与抗张素抗血清反应。用增强化学发光法开发印迹（Amersham Corp.，Arlington Heights，IL）。在野生型和杂合子成纤维细胞的蛋白质样品中检测到一条与小鼠张力蛋白大小相对应的200-kD条带，但在张力蛋白缺失的成纤维细胞中未检测到。
图4
图4
胚胎干细胞和小鼠中张力蛋白基因的破坏。(一个)靶向载体和张力蛋白位点的同源重组。所示为小鼠紧张素基因部分的部分限制性内切酶图谱。(打开箱子)用于靶向的5′和3′侧翼序列；(黑匣子)用于Southern印迹分析的5′和3′基因组DNA探针；(PGK-新和PGK-TK公司)在磷酸甘油激酶1启动子的控制下，新霉素抗性和疱疹胸苷激酶基因分别用于阳性和阴性选择。B类巴米希；E类、EcoRI；服务提供商，SpeI；S公司、SacI；X（X），XhoI。(B类)从+/+、+/-和−/−小鼠尾部分离的DNA的Southern blot分析。用限制性内切酶EcoRI消化小鼠尾部DNA(左边)或BamHI(中间的和正确的)经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离。转移到硝酸纤维素纸上后，用放射性标记的cDNA探针杂交印迹，探针对应于图中所示的5′和3′片段一个，并发送至PGK-新基因（5′EcoRI–BamHI片段）如图所示。(星号)成功同源重组事件的预期带（2.8 kb，5′探针；0.4 kb，3′探针）；(箭头)野生型基因组预期带（4kb，5′探针；6.8kb，3′探针）；(箭头)新霉素探针带（3.8kb）。(C类)来源于+/+、+/−和−/-15-d小鼠胚胎的成纤维细胞中张力蛋白的免疫印迹分析。从15天小鼠胚胎的皮肤培养成纤维细胞。全细胞裂解物（30μg）通过7%聚丙烯酰胺SDS凝胶进行电泳，然后转移至硝化纤维素。在用Ponceau S染色以确认蛋白质负载相等（未显示）后，印迹与抗张素抗血清反应。用增强化学发光法开发印迹（Amersham Corp.，Arlington Heights，IL）。在野生型和杂合子成纤维细胞的蛋白质样品中检测到一条与小鼠张力蛋白大小相对应的200-kD条带，但在张力蛋白缺失的成纤维细胞中未检测到。
图5
图5
张力蛋白−/−小鼠肾脏的整体外观和组织病理学异常。(一个)在不同年龄段处死野生型或无张力蛋白小鼠，分离并检查其肾脏。显示了来自(从左到右)：23周+/+、6周−/−、14周−/−、28周−/O-和36周−/o-小鼠。注意所有年龄段的无张力肾的苍白颜色。(B类)图示为来自(从左到右)：23周+/+、28周−/-和14周−/-小鼠。(C–F类)将18周龄无张力蛋白小鼠及其对照野生型窝鼠的肾脏置于甲醛固定剂中，切片（5μm），并用苏木精和伊红染色。所示为+/+肾脏的代表性切片(C类; 方框表示放大的区域E类)和−/−(D类; 方框表示放大的区域F类)老鼠。注意击倒中与肾盂相对应的扩大空间(星号在里面D类). 注意−/−肾切片中存在大量囊肿，这是基因敲除动物的典型特征。(G–I型)如上文所述，对4周龄无张力蛋白小鼠及其对照窝鼠的肾脏进行固定和染色。所示为的代表性部分(G–H（G–H）)+/+的皮层区域(克)和−/−(H（H）)肾脏；再次注意囊肿的流行(开放的圆圈)在敲除的肾脏中。克，肾小球。(我)−/−皮层切片，以说明含有非晶形材料的囊肿(C类)，通常被称为铸件(双箭头在里面F类). (J型)−/−肾小球切片，显示鲍曼空间中的大空间(双箭头)常见于肾功能不全导致囊内积液时（另见箭头在里面F类). (K)球墨藻属(克)来源于野生型肾脏；注意鲍曼空间周围的法线间距。(L（左）)无张力肾肾小球；注意，这些肾小球被不典型的立方上皮细胞包围，细胞浆突出(箭头)而不是正常的薄扁平上皮，在对照肾小球中几乎看不到。(开放式圆圈)囊肿。(M（M）)张力蛋白−/−肾的肾小球，被高度不规则的上皮细胞包围；还请注意，似乎是细胞外物质，可能是胶原蛋白，类似于人类局灶节段肾小球硬化症。(N个)无张力肾的区域，显示局灶性间质炎性浸润的明显迹象。酒吧：(C类和D类)740微米；(E类和F类)400微米；(克和H（H）)100微米；(我和N个)50微米；(K–M公司)25微米；(J型)17微米。
图5
图5
张力蛋白−/−小鼠肾脏的整体外观和组织病理学异常。(一个)在不同年龄段处死野生型或无张力蛋白小鼠，分离并检查其肾脏。显示了来自(从左到右)：23周+/+、6周−/−、14周−/−、28周−/O-和36周−/o-小鼠。注意所有年龄段的无张力肾的苍白颜色。(B类)图示为来自(从左到右)：23周+/+、28周−/-和14周−/-小鼠。(C–F类)将18周龄无张力蛋白小鼠及其对照野生型窝鼠的肾脏置于甲醛固定剂中，切片（5μm），并用苏木精和伊红染色。所示为+/+肾脏的代表性切片(C类; 方框表示放大的区域E类)和−/−(D类; 方框表示放大的区域F类)老鼠。注意击倒中与肾盂相对应的扩大空间(星号在里面D类). 注意−/−肾切片中存在大量囊肿，这是基因敲除动物的典型特征。(G–I型)如上所述，固定并染色来自4岁无张力素小鼠及其同窝对照的肾脏。所示为的代表性部分(G–H（G–H）)+/+的皮层区域(克)和−/−(H（H）)肾脏；再次注意囊肿的流行(开放的圆圈)在敲除的肾脏中。克，肾小球。(我)−/−皮层切片，以说明含有非晶形材料的囊肿(C类)，通常称为cast(双箭头在里面F类). (J型)−/−肾小球切片，显示鲍曼空间中的大空间(双箭头)常见于肾功能不全导致囊内积液时（另见箭头在里面F类). (K)格洛默鲁利(克)来源于野生型肾脏；注意鲍曼空间周围的法线间距。(L（左）)无张力肾肾小球；注意，这些肾小球被不典型的立方上皮细胞包围，细胞浆突出(箭头)而不是正常的薄扁平上皮，在对照肾小球中几乎看不到。(开放式圆圈)囊肿。(M（M）)张力蛋白−/−肾的肾小球，被高度不规则的上皮细胞包围；还请注意，似乎是细胞外物质，可能是胶原蛋白，类似于人类局灶节段肾小球硬化症。(N个)无张力肾的区域，显示局灶性间质炎性浸润的明显迹象。酒吧：(C类和D类)740微米；(E类和F类)400微米；(克和H（H）)100微米；(我和N个)50微米；(K–M公司)25微米；(J型)17微米。
图6
图6
肾单位和近端小管上皮的示意图。肾脏由一百多万个肾单位组成，肾单位是肾脏的功能单位。血液在每个肾单位开始时进入肾小球。过滤去除蛋白质和细胞后，剩余的液体主要由水和小分子组成，如盐、氨基酸和葡萄糖，穿过肾小球周围的鲍曼囊，进入近端小管。在这里，大多数营养物质通过小管的极化上皮被重新吸收（放大方框区域以显示右侧的上皮）。未被再吸收的部分液体继续通过肾小管，以尿液的形式存在。近端小管上皮与远端小管上皮的不同之处在于，它包含一个厚的刷状缘，可高效吸收小分子。上皮的基底侧起伏，形成所谓的基底外侧迷路，它包裹着为运输提供能量所必需的大量线粒体。将上皮的基底表面与毛细血管的内皮壁分离是由ECM组成的基底膜。整合素介导的基底表面与底层ECM的粘附被认为是上皮极化和进行适当转运的关键。肾小球和近端和远端小管位于肾脏的最外层，即皮质；位于肾髓质的集合管将尿液输送至肾盂。
图7
图7
张力蛋白在小鼠肾脏的上皮小管中表达。将一只野生型小鼠的肾脏进行甲醛固定、加工、石蜡包埋，并进行矢状切片。然后用抗小鼠紧张素的一级抗体标记切片（5μm），然后用免疫金结合的山羊抗兔IgG二级抗体增强(一个). 在中的控制部分B类免疫前血清用于标记反应。C类皮质，包含肾小球和近端/远端小管（注意小管上有明显标记）；M（M）髓质，包含集合管和Henle氏环（注意集合小管上的标记较弱）；P（P），肾盂。棒材，260μm。
图8
图8
免疫电子显微镜显示野生型肾小管基底表面两种类型的局灶性接触中存在紧张素。对野生型小鼠的肾脏进行常规或免疫电子显微镜检查。图示为近端小管上皮细胞的超薄切片。(一个)极化上皮细胞，显示上皮基底部、基底膜附近和大量微绒毛内陷(箭头)在顶端表面。注意大量线粒体(米)，反映细胞基底端附近的运输活动。米线粒体；努，细胞核。(B类)用抗紧张素抗体标记的上皮细胞。注意上皮底部有两个非常大的致密颗粒簇（同样在高倍镜下插入)，靠近基底层(BL公司). 还应注意上皮内陷尖端附近有更多较小的颗粒簇，上皮与基底层接触。无论小管上皮与下面的基底层接触何处，都可以在整个组织中看到这两种类型的标记。抗p130cas的抗体也出现了类似的标记，p130是另一种局灶性粘附蛋白（未显示）。注意，我们经常在基底层内的区域观察到金颗粒；这种（和其他）标记对针对局灶性粘附蛋白的抗体是特异性的。我们推测，高度定位但似乎是细胞外的标记是一种伪影，可能是在固定过程中细胞表面轻微回缩产生的。欧盟委员会，内皮细胞。酒吧：(一个)3微米；和(B类)0.5微米。
图8
图8
免疫电子显微镜显示野生型肾小管基底表面两种类型的局灶性接触中存在张力蛋白。对野生型小鼠的肾脏进行常规或免疫电子显微镜检查。图示为近端小管上皮细胞的超薄切片。(一个)极化上皮细胞，显示上皮基底部、基底膜附近和大量微绒毛内陷(箭头)在顶端表面。注意大量线粒体(米)，反映细胞基底端附近的运输活动。米线粒体；努，细胞核。(B类)用抗紧张素抗体标记的上皮细胞。注意上皮底部有两个非常大的致密颗粒簇（同样在高倍镜下插入)，靠近基底层(BL公司). 还应注意上皮内陷尖端附近有更多较小的颗粒簇，上皮与基底层接触。无论小管上皮与下面的基底层接触何处，都可以在整个组织中看到这两种类型的标记。针对另一种局灶性粘附蛋白p130cas的抗体也出现了类似的标记（未显示）。注意，我们经常在基底层内的区域观察到金颗粒；这种（和其他）标记对针对黏附蛋白的抗体具有特异性。我们推测，高度定位但似乎是细胞外的标记是一种伪影，可能是在固定过程中细胞表面轻微回缩产生的。欧盟委员会，内皮细胞。酒吧：(一个)3微米；和(B类)0.5微米。
图9
图9
免疫电镜显示，无张力肾小管表面正常区域存在局灶性粘连，囊性肾小管无局灶性粘附。对无张力蛋白小鼠的肾脏进行常规或免疫电子显微镜检查（见材料和方法）。图示为轻度受累或看似未受累区域近端小管上皮细胞的超薄切片(一个,C类、和E类)和严重受影响地区(B类,D类、和F类). (一个)来自轻度受累区域的近端小管细胞。请注意，上皮是极化的，顶端表面有许多微绒毛。在一些区域，如这个区域，唯一检测到的异常是基底膜的波动较少；然而，这种差异并不总是可见的。(B类)来自严重受累区域的近端小管细胞。请注意，只有少数残留微绒毛，上皮细胞几乎没有极化的迹象。(C–F类). 用p130抗体标记的管状上皮细胞(C类和D类). 注意，轻度受影响的上皮细胞仍然显示出局灶性粘连的标记(箭头在里面C类). 偶尔也可以看到类似于图8所示的大型焦点接触。请注意，严重受累区域没有明显的标记，表明局部粘连消失。(E类和F类). 用抗钠钾ATP酶抗体标记的肾小管上皮细胞(E类和F类). 请注意，轻度受累区域仍显示出基底外侧表面的标记，这是典型的野生型对照（未显示）。请注意，严重受累区域没有明显的标记，表明细胞极性丧失。努，细胞核，M（M），线粒体。条形图：(一个)2.3微米；(B类)1.3微米；(C类)0.6微米；(D类)0.4微米；(E类和F类)0.7微米。
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