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.1997年1月13日；136(1):215-27.
doi:10.1083/jcb.136.1.215。

抑制Ced-3/ICE相关蛋白酶不能阻止癌基因、DNA损伤或Bcl-2同源物Bak诱导的细胞死亡

N J麦卡锡 1, M K怀特, C S吉尔伯特, G I Evan公司
附属公司

抑制Ced-3/ICE相关蛋白酶不能阻止癌基因、DNA损伤或Bcl-2同源物Bak诱导的细胞死亡

N J麦卡锡等。 J细胞生物学. .

摘要

越来越多的证据表明，半胱氨酸蛋白酶的白细胞介素-1β转化酶（ICE）家族在哺乳动物细胞凋亡中起着核心作用，半胱胱氨酸蛋白酶是线虫“死亡”基因产物ced-3的同源物。Ced-3被认为是线虫细胞程序性死亡的执行者而非调节者。然而，目前尚不清楚哺乳动物ICE相关蛋白酶（IRP）是否参与哺乳动物细胞凋亡的执行或调节。此外，哺乳动物细胞凋亡对一个或多个IRP的绝对要求尚未确定。我们使用了两种IRP的细胞渗透抑制剂，Z-Val-Ala-Asp.氟甲基酮（ZVAD.fmk）和叔丁氧羰基-Asp.氟甲基酮（BD.fmk，为了证明IRP在几种不同机制（癌基因表达失调、Bcl-2相关Bak的异位表达和DNA损伤诱导的细胞死亡）诱导的哺乳动物凋亡中的关键作用。在所有情况下，ZVAD.fmk和BD.fmk治疗抑制与细胞凋亡相关的特征性生化和形态学事件，包括核层粘连蛋白和聚（ADP-核糖）聚合酶的切割、染色质缩合和核小体梯化，以及磷脂酰丝氨酸的外显。然而，ZVAD.fmk和BD.fmk都不能抑制细胞凋亡的发生，其特征是表面起泡；相反，一旦启动，两者都会延迟项目的完成。相反，IGF-I和Bcl-2延迟了细胞凋亡的发生，但一旦启动，对程序的动力学没有影响。我们的数据表明，IRP构成了由解除调控的致癌基因、DNA损伤或Bak诱导的哺乳动物细胞凋亡执行机制的一部分，但它们的作用是在细胞发生凋亡或可被生存因子挽救的时刻之后。此外，所有这些被阻断的细胞都失去了增殖潜能，最终都会因细胞质泡状变而死亡。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
ICE相关蛋白酶的细胞渗透性抑制剂ZVAD.fmk和BD.fmk抑制癌基因、DNA损伤和Bak诱导的凋亡。通过延时视频显微镜观察Rat-1细胞培养，并以12帧/小时的速度收集图像。在每个5小时周期结束时，对迄今为止的凋亡事件总数（由细胞分离确定）进行汇总并绘制时间曲线。在每种培养物中，细胞凋亡事件的发生率显示为是否存在ZVAD.fmk（100μM）。在时间0添加ZVAD.fmk和他莫昔芬（如适用）。(A类)在存在（▴）或不存在（•）ZVAD.fmk的情况下表达c-Myc-ER™的Rat-1细胞。c-Myc通过添加4-OHT（100 nM）被激活。(B类)在存在（▴）或不存在（•）ZVAD.fmk的情况下，在GalER-VP16启动子的控制下表达Bak的Rat-1细胞。GalER-VP16嵌合转录因子通过添加4-OHT（到100 nM）被激活，从而诱导Bak的表达。(C)在存在（▴）或不存在（•）ZVAD.fmk的情况下，Rat-1细胞组成性表达腺病毒E1A蛋白。(天)表达c-MycER™的Rat-1细胞，在有（▴）或无（•）ZVAD.fmk的情况下用足叶乙甙/VP16（100 nM）处理。通过添加4-OHT（至100 nM）再次激活c-Myc。
图2
图2
ZVAD.fmk和BD.fmk不延迟细胞死亡的开始，但阻止细胞膜起泡后凋亡的完成(A类)ZVAD.fmk不会延迟细胞死亡的发生，但会扩展单个凋亡事件的动力学。在存在（▴）或不存在（•）ZVAD.fmk（至100μM）的情况下，通过4-OHT（100 nM）对Rat-1/c-MycER™细胞中诱导的凋亡起始时间进行视频显微镜定量。与之前一样进行时间推移视频显微镜检查，但对细胞膜起泡进行评分(B类)在没有血清的情况下，ZVAD.fmk和BD.fmk在c-Myc诱导后24小时都显示出深刻的细胞质起泡。Rat-1/c-MycER™细胞在添加有或没有100μM ZVAD.fmk或5μM BD.fmk的4-OHT（100 nM）之前，血清饥饿48小时。24小时后，用霍夫曼光学显微镜检查细胞。两张照片都显示了用ZVAD.fmk或BD.fmk处理过的起泡细胞的典型区域。
图2
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ZVAD.fmk和BD.fmk不延迟细胞死亡的开始，但阻止细胞膜起泡后凋亡的完成(A类)ZVAD.fmk不会延迟细胞死亡的发生，但会扩展单个凋亡事件的动力学。在存在（▴）或不存在（•）ZVAD.fmk（至100μM）的情况下，通过4-OHT（100 nM）对Rat-1/c-MycER™细胞中诱导的凋亡起始时间进行视频显微镜定量。与之前一样进行时间推移视频显微镜检查，但对细胞膜起泡进行评分(B类)在没有血清的情况下，c-Myc诱导24小时后，ZVAD.fmk和BD.fmk均显示出严重的细胞质起泡。Rat-1/c-MycER™细胞在添加有或没有100μM ZVAD.fmk或5μM BD.fmk的4-OHT（100 nM）之前，血清饥饿48小时。24小时后，用霍夫曼光学显微镜检查细胞。两张照片都显示了用ZVAD.fmk或BD.fmk处理的起泡细胞的代表性区域。
图2
图2
ZVAD.fmk和BD.fmk不延迟细胞死亡的开始，但阻止细胞膜起泡后凋亡的完成(A类)ZVAD.fmk不会延迟细胞死亡的发生，但会扩展单个凋亡事件的动力学。在存在（▴）或不存在（•）ZVAD.fmk（至100μM）的情况下，通过4-OHT（100 nM）对Rat-1/c-MycER™细胞中诱导的凋亡起始时间进行视频显微镜定量。与之前一样进行时间推移视频显微镜检查，但对细胞膜起泡进行评分(B类)在没有血清的情况下，c-Myc诱导24小时后，ZVAD.fmk和BD.fmk均显示出严重的细胞质起泡。Rat-1/c-MycER™细胞在添加有或没有100μM ZVAD.fmk或5μM BD.fmk的4-OHT（100 nM）之前，血清饥饿48小时。24小时后，用霍夫曼光学显微镜检查细胞。两张照片都显示了用ZVAD.fmk或BD.fmk处理过的起泡细胞的典型区域。
图3
图3
ZVAD.fmk可延迟细胞凋亡特征标志物的出现。(A类)ZVAD.fmk延缓线粒体完整性的破坏。Rat-1/c-MycER™细胞在含有10%FCS的DME中以约3000个细胞/孔的密度被镀入96个板中。培养48小时后，将培养基替换为无血清培养基，细胞再保留48小时。再次清洗细胞，用含有100 nM 4-OHT或4-OHT加ZVAD.fmk的生长培养基替换培养基，如图所示。然后用MTT光度法在不同时间测定线粒体完整性。条形代表四个重复培养孔±SDs的平均值。所示数据来自单个代表性实验。(B类)流式细胞术分析Rat-1/c-MycER™细胞在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下接受c-Myc诱导的细胞凋亡。在时间0时，将4-OHT±ZVAD.fmk添加到缺血清细胞中。然后在指定的时间点通过胰酶消化法获取细胞。细胞在乙醇中固定，用碘化丙啶染色，并用流式细胞仪检测。凋亡细胞的亚G1峰特征在ZVAD.fmk处理的群体中不存在。
图3
图3
ZVAD.fmk延迟细胞凋亡特征性标志物的出现。(A类)ZVAD.fmk延缓线粒体完整性的破坏。Rat-1/c-MycER™细胞在含有10%FCS的DME中以约3000个细胞/孔的密度被镀入96个板中。培养48小时后，将培养基替换为无血清培养基，细胞再保留48小时。再次清洗细胞，用含有100 nM 4-OHT或4-OHT加ZVAD.fmk的生长培养基替换培养基，如图所示。然后用MTT光度法在不同时间测定线粒体完整性。条形代表四个重复培养孔±SDs的平均值。所示数据来自单个代表性实验。(B类)流式细胞术分析Rat-1/c-MycER™细胞在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下接受c-Myc诱导的细胞凋亡。在时间0时，将4-OHT±ZVAD.fmk添加到缺血清细胞中。然后，在指定的时间点，通过胰蛋白酶作用收获细胞。细胞在乙醇中固定，用碘化丙啶染色，并用流式细胞仪检测。ZVAD.fmk处理的人群中没有凋亡细胞的亚G1峰特征。
图4
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ZVAD.fmk抑制低血清中表达活化c-Myc的Rat-1/c-MycER™细胞中已知ICE相关蛋白酶底物的裂解。(A类)对Rat-1/c-MycER™细胞中三种已知IRP底物的裂解进行免疫印迹分析，其中c-Myc在低血清中在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下被激活。(我)ZVAD.fmk抑制层粘连蛋白A和C的裂解。ZVAD.fmk治疗抑制了24和48 h时凋亡中典型的46-kD IRP裂解产物的出现（Oberhammer等人，1994）1，时间为0个单元格；车道224小时对照细胞；车道三24小时ZVAD.fmk处理细胞；车道448小时对照细胞；车道5，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(ii（ii）)ZVAD.fmk对PARP裂解的抑制作用。PARP的IRP裂解在凋亡细胞中产生特征性的85-kD片段（Lazebnik等人，1994年）。在非ZVAD.fmk处理的Rat-1/cMycER™细胞中，85-kD PARP片段在24小时后可见，在48小时后进一步增加1，时间0控制单元；车道2，时间为0的ZVAD.fmk处理细胞；车道三24小时对照细胞；车道424小时ZVAD.fmk处理细胞；车道548小时对照细胞；车道6，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(三)ZVAD.fmk抑制凋亡细胞中的肌动蛋白分裂，其特征是出现被所用抗体识别的15-kD片段。该片段的出现被ZVAD.fmk抑制。车道1，时间为0个细胞；车道248小时对照细胞；车道三48小时ZVAD.fmk处理细胞；车道496小时对照细胞；车道5，96-h ZVAD.fmk处理的细胞。(B类)已知IRP底物分布的共焦免疫荧光显微镜。(我)用抗层粘连蛋白A+c抗体染色的活性Rat-1/c-MycER™细胞在核外周表现出典型的层粘连染色。在凋亡细胞中，由于层粘连的降解和扩散，这种染色不存在。相反，与对照组相比，ZVAD.fmk处理的起泡细胞表现出接近正常的层粘连A+C染色。(ii（ii）)Rat-1/c-MycER™细胞用卵磷脂-FITC染色以检查肌动蛋白的分布。活细胞呈现正常肌动蛋白纤维；凋亡细胞浓缩，未见肌动蛋白丝。在ZVAD.fmk处理的细胞中，肌动蛋白聚集在细胞表面的气泡中。值得注意的是，与有活力的细胞相比，起泡细胞的大小明显减小。(三)存活和起泡的Rat-1/c-MycER™细胞均呈现核PARP染色，这在凋亡细胞中不存在。棒材，10μm。
图4
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ZVAD.fmk抑制低血清中表达活化c-Myc的Rat-1/c-MycER™细胞中已知ICE相关蛋白酶底物的裂解。(A类)对Rat-1/c-MycER™细胞中三种已知IRP底物的裂解进行免疫印迹分析，其中c-Myc在低血清中在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下被激活。(我)ZVAD.fmk抑制层粘连蛋白A和C的裂解。ZVAD.fmk治疗抑制了24和48 h时凋亡中典型的46-kD IRP裂解产物的出现（Oberhammer等人，1994）1，时间为0个单元格；车道224小时对照细胞；车道三24小时ZVAD.fmk处理细胞；车道448小时对照细胞；车道5，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(ii（ii）)ZVAD.fmk对PARP裂解的抑制作用。PARP的IRP裂解在凋亡细胞中产生特征性的85-kD片段（Lazebnik等人，1994年）。在非ZVAD.fmk处理的Rat-1/cMycER™细胞中，85-kD PARP片段在24小时后可见，在48小时后进一步增加1，时间0控制单元；车道2，时间为0的ZVAD.fmk处理细胞；车道三24小时对照细胞；车道424小时ZVAD.fmk处理细胞；车道548小时对照细胞；车道6，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(三)ZVAD.fmk抑制凋亡细胞中的肌动蛋白分裂，其特征是出现被所用抗体识别的15-kD片段。该片段的出现被ZVAD.fmk抑制。车道1，时间为0个单元格；车道2，48小时对照细胞；车道三48小时ZVAD.fmk处理细胞；车道496小时对照细胞；车道596-h ZVAD.fmk处理的细胞。(B类)已知IRP底物分布的共聚焦免疫荧光显微镜。(我)用抗层粘连蛋白A+c抗体染色的活性Rat-1/c-MycER™细胞在核外周表现出典型的层粘连染色。在凋亡细胞中，由于层粘连的降解和扩散，这种染色不存在。相反，与对照组相比，ZVAD.fmk处理的起泡细胞表现出接近正常的层粘连A+C染色。(ii（ii）)Rat-1/c-MycER™细胞用卵磷脂-FITC染色以检查肌动蛋白的分布。活细胞呈现正常肌动蛋白纤维；凋亡细胞浓缩，未见肌动蛋白丝。在ZVAD.fmk处理的细胞中，肌动蛋白聚集在细胞表面的气泡中。请注意，与活细胞相比，泡状细胞的大小明显减小。(三)存活和起泡的Rat-1/c-MycER™细胞都表现出核PARP染色，而凋亡细胞中没有这种染色。棒材，10μm。
图4
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ZVAD.fmk抑制低血清中表达活化c-Myc的Rat-1/c-MycER™细胞中已知ICE相关蛋白酶底物的裂解。(A类)对Rat-1/c-MycER™细胞中三种已知IRP底物的裂解进行免疫印迹分析，其中c-Myc在低血清中在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下被激活。(我)ZVAD.fmk抑制层粘连蛋白A和C的裂解。ZVAD.fmk治疗抑制了24和48 h时凋亡中典型的46-kD IRP裂解产物的出现（Oberhammer等人，1994）1，时间为0个单元格；车道224小时对照细胞；车道三24小时ZVAD.fmk处理细胞；车道448小时对照细胞；车道5，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(ii（ii）)ZVAD.fmk对PARP裂解的抑制作用。PARP的IRP裂解在凋亡细胞中产生特征性的85-kD片段（Lazebnik等人，1994年）。在非ZVAD.fmk处理的Rat-1/cMycER™细胞中，85-kD PARP片段在24小时后可见，在48小时后进一步增加1，时间0控制单元；车道2，时间为0的ZVAD.fmk处理细胞；车道三24小时对照细胞；车道424小时ZVAD.fmk处理细胞；车道548小时对照细胞；车道6，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(三)ZVAD.fmk抑制凋亡细胞中的肌动蛋白分裂，其特征是出现被所用抗体识别的15-kD片段。该片段的出现被ZVAD.fmk抑制。车道1，时间为0个单元格；车道248小时对照细胞；车道三，48小时ZVAD.fmk处理的细胞；车道496小时对照细胞；车道596-h ZVAD.fmk处理的细胞。(B类)已知IRP底物分布的共焦免疫荧光显微镜。(我)用抗层粘连蛋白A+c抗体染色的存活Rat-1/c-MycER™细胞在核外周显示出特征性层粘连蛋白染色。在凋亡细胞中，由于层粘连的降解和扩散，这种染色不存在。相反，与对照组相比，ZVAD.fmk处理的起泡细胞表现出接近正常的层粘连A+C染色。(ii（ii）)Rat-1/c-MycER™细胞用卵磷脂-FITC染色以检查肌动蛋白的分布。活细胞呈现正常肌动蛋白纤维；凋亡细胞浓缩，未见肌动蛋白丝。在ZVAD.fmk处理的细胞中，肌动蛋白聚集在细胞表面的气泡中。请注意，与活细胞相比，泡状细胞的大小明显减小。(三)存活和起泡的Rat-1/c-MycER™细胞均呈现核PARP染色，这在凋亡细胞中不存在。棒材，10μm。
图4
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ZVAD.fmk抑制低血清中表达活化c-Myc的Rat-1/c-MycER™细胞中已知ICE相关蛋白酶底物的裂解。(A类)对Rat-1/c-MycER™细胞中三种已知IRP底物的裂解进行免疫印迹分析，其中c-Myc在低血清中在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下被激活。(我)ZVAD.fmk抑制层粘连蛋白A和C的裂解。ZVAD.fmk治疗抑制了24和48 h时凋亡中典型的46-kD IRP裂解产物的出现（Oberhammer等人，1994）1，时间为0个单元格；车道224小时对照细胞；车道三24小时ZVAD.fmk处理细胞；车道448小时对照细胞；车道5，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(ii（ii）)ZVAD.fmk对PARP切割的抑制作用。PARP的IRP裂解在凋亡细胞中产生特征性的85-kD片段（Lazebnik等人，1994年）。在非ZVAD.fmk处理的Rat-1/cMycER™细胞中，85-kD PARP片段在24小时后可见，在48小时后进一步增加1，时间0控制单元；车道2，时间为0的ZVAD.fmk处理细胞；车道三24小时对照细胞；车道424小时ZVAD.fmk处理细胞；车道548小时对照细胞；车道6，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(三)ZVAD.fmk抑制凋亡细胞中的肌动蛋白分裂，其特征是出现被所用抗体识别的15-kD片段。该片段的出现被ZVAD.fmk抑制。车道1，时间为0个单元格；车道248小时对照细胞；车道三48小时ZVAD.fmk处理细胞；车道4，96-h对照细胞；车道596-h ZVAD.fmk处理的细胞。(B类)已知IRP底物分布的共焦免疫荧光显微镜。(我)用抗层粘连蛋白A+c抗体染色的活性Rat-1/c-MycER™细胞在核外周表现出典型的层粘连染色。在凋亡细胞中，由于层粘连蛋白的降解和扩散，这种染色是不存在的。相反，与对照组相比，ZVAD.fmk处理的起泡细胞表现出接近正常的层粘连A+C染色。(ii（ii）)Rat-1/c-MycER™细胞用卵磷脂-FITC染色以检查肌动蛋白的分布。活细胞呈现正常肌动蛋白纤维；凋亡细胞浓缩，未见肌动蛋白丝。在ZVAD.fmk处理的细胞中，肌动蛋白聚集在细胞表面的气泡中。请注意，与活细胞相比，泡状细胞的大小明显减小。(三)存活和起泡的Rat-1/c-MycER™细胞均呈现核PARP染色，这在凋亡细胞中不存在。棒材，10μm。
图4
图4
ZVAD.fmk抑制低血清中表达活化c-Myc的Rat-1/c-MycER™细胞中已知ICE相关蛋白酶底物的裂解。(A类)对Rat-1/c-MycER™细胞中三种已知IRP底物的裂解进行免疫印迹分析，其中c-Myc在低血清中在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下被激活。(我)ZVAD.fmk抑制层粘连蛋白A和C的裂解。ZVAD.fmk治疗抑制了24和48 h时凋亡中典型的46-kD IRP裂解产物的出现（Oberhammer等人，1994）1，时间为0个单元格；车道224小时对照细胞；车道三24小时ZVAD.fmk处理细胞；车道448小时对照细胞；车道5，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(ii（ii）)ZVAD.fmk对PARP裂解的抑制作用。PARP的IRP裂解在凋亡细胞中产生特征性的85-kD片段（Lazebnik等人，1994年）。在非ZVAD.fmk处理的Rat-1/cMycER™细胞中，85-kD PARP片段在24小时后可见，在48小时后进一步增加1，时间0控制单元；车道2，时间为0的ZVAD.fmk处理细胞；车道三24小时对照细胞；车道424小时ZVAD.fmk处理细胞；车道548小时对照细胞；车道6，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(三)ZVAD.fmk抑制凋亡细胞中的肌动蛋白分裂，其特征是出现被所用抗体识别的15-kD片段。该片段的出现被ZVAD.fmk抑制。车道1，时间为0个单元格；车道248小时对照细胞；车道三48小时ZVAD.fmk处理细胞；车道496小时对照细胞；车道5，96-h ZVAD.fmk处理的细胞。(B类)已知IRP底物分布的共焦免疫荧光显微镜。(我)用抗层粘连蛋白A+c抗体染色的活性Rat-1/c-MycER™细胞在核外周表现出典型的层粘连染色。在凋亡细胞中，由于层粘连的降解和扩散，这种染色不存在。相反，与对照组相比，ZVAD.fmk处理的起泡细胞表现出接近正常的层粘连蛋白A+C染色。(ii（ii）)Rat-1/c-MycER™细胞用卵磷脂-FITC染色以检查肌动蛋白的分布。活细胞呈现正常肌动蛋白纤维；凋亡细胞浓缩，未见肌动蛋白丝。在ZVAD.fmk处理的细胞中，肌动蛋白聚集在细胞表面的气泡中。请注意，与活细胞相比，泡状细胞的大小明显减小。(三)存活和起泡的Rat-1/c-MycER™细胞均呈现核PARP染色，这在凋亡细胞中不存在。棒材，10μm。
图4
图4
ZVAD.fmk抑制在低血清中表达活化c-Myc的Rat-1/c-MycER™细胞中ICE相关蛋白酶的已知底物的切割。(A类)对Rat-1/c-MycER™细胞中三种已知IRP底物的裂解进行免疫印迹分析，其中c-Myc在低血清中在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下被激活。(我)ZVAD.fmk抑制层粘连蛋白A和C的裂解。ZVAD.fmk治疗抑制了24和48 h时凋亡中典型的46-kD IRP裂解产物的出现（Oberhammer等人，1994）1，时间为0个单元格；车道224小时对照细胞；车道三24小时ZVAD.fmk处理细胞；车道448小时对照细胞；车道5，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(ii（ii）)ZVAD.fmk对PARP裂解的抑制作用。PARP的IRP裂解在凋亡细胞中产生特征性的85-kD片段（Lazebnik等人，1994年）。在非ZVAD.fmk处理的Rat-1/cMycER™细胞中，85-kD PARP片段在24小时后可见，在48小时后进一步增加1，时间0控制单元；车道2，时间为0的ZVAD.fmk处理细胞；车道三24小时对照细胞；车道424小时ZVAD.fmk处理细胞；车道548小时对照细胞；车道6，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(三)ZVAD.fmk抑制凋亡细胞中的肌动蛋白分裂，其特征是出现被所用抗体识别的15-kD片段。该片段的出现被ZVAD.fmk抑制。车道1，时间为0个单元格；车道248小时对照细胞；车道三48小时ZVAD.fmk处理细胞；车道496小时对照细胞；车道596-h ZVAD.fmk处理的细胞。(B类)已知IRP底物分布的共聚焦免疫荧光显微镜。(我)用抗层粘连蛋白A+c抗体染色的活性Rat-1/c-MycER™细胞在核外周表现出典型的层粘连染色。在凋亡细胞中，由于层粘连的降解和扩散，这种染色不存在。相反，与对照组相比，ZVAD.fmk处理的起泡细胞表现出接近正常的层粘连A+C染色。(ii（ii）)Rat-1/c-MycER™细胞用鬼笔肽-FITC染色，以检查肌动蛋白的分布。活细胞呈现正常肌动蛋白纤维；凋亡细胞浓缩，未见肌动蛋白丝。在ZVAD.fmk处理的细胞中，肌动蛋白聚集在细胞表面的气泡中。请注意，与活细胞相比，泡状细胞的大小明显减小。(三)存活和起泡的Rat-1/c-MycER™细胞均呈现核PARP染色，这在凋亡细胞中不存在。棒材，10μm。
图5
图5
在存在和不存在ZVAD.fmk的情况下，对缺乏血清的Rat-1/c-MycER™细胞的凋亡进行电镜分析。在低血清中经历4-OHT诱导的细胞凋亡的单个Rat-1/c-MycER™细胞的电子显微镜分析。(A类)正常、存活的Rat-1/c-MycER™细胞。(B类)典型的凋亡细胞。(C和天)在形态学变化的早期和晚期，ZVAD.fmk的存在会诱导细胞凋亡，表现出明显的细胞质起泡，但没有染色质凝集。棒材，1μm。
图6
图6
细胞表面磷脂酰丝氨酸的表达。ZVAD.fmk延缓了膜联蛋白V结合的出现。在有或无ZVAD.fmk的情况下，通过相控显微镜检查c-Myc诱导凋亡的缺血清Rat-1/cMycER™细胞，以确定其形态(一和c（c）). 然后将FITC-标记的膜联蛋白V添加到培养皿中，使其最终浓度达到2.5μg/ml，并通过荧光显微镜检查相同的细胞(b条和d日). 在缺乏ZVAD.fmk的情况下，凋亡细胞被膜联蛋白V染色(一和b条). 相反，ZVAD.fmk处理的起泡细胞不结合膜联蛋白V(c（c）和d日).
图7
图7
IGF-I和Bcl-2延迟凋亡程序的启动，但不延迟其执行。用100 nM 4-OHT处理缺乏血清的Rat-1/c-MycER™细胞，以激活c-Myc，然后进行延时视频显微镜检查。细胞凋亡的起始点在起泡开始时计分。细胞死亡的终点在细胞分离点计分，两者之间的时间用水平线的长度表示。(A类)IGF-1存在或不存在时的凋亡事件。IGF-1对Myc诱导凋亡动力学的影响。(B类)Bcl-2表达对Myc诱导凋亡动力学的影响。存在或不存在共表达Bcl-2的凋亡事件。
图7
图7
IGF-I和Bcl-2延迟凋亡程序的启动，但不延迟其执行。用100 nM 4-OHT处理血清剥夺的Rat-1/c-MycER™细胞以激活c-Myc，随后进行延时视频显微镜检查。细胞凋亡的起始点在起泡开始时计分。细胞死亡的终点在细胞分离点计分，两者之间的时间用水平线的长度表示。(A类)IGF-1存在或不存在时的凋亡事件。IGF-1对Myc诱导凋亡动力学的影响。(B类)Bcl-2表达对Myc诱导的细胞凋亡动力学的影响。存在或不存在共表达Bcl-2的凋亡事件。
图8
图8
一旦ZVAD.fmkblocked凋亡细胞开始起泡，血清生存因子并不能拯救它们。通过添加4-OHT，在缺乏血清的Rat-1/c-MycER™成纤维细胞中诱导凋亡，并通过时间推移视频显微镜观察细胞。添加4-OHT后40小时，将FCS添加回生长培养基，使最终浓度达到10%。随后追踪引发膜泡的细胞，以确定其命运。图中显示了18个独立细胞命运的代表性研究。如前所述，测定膜起泡（•）和细胞死亡（|）的起始时间，两者之间的时间间隔由水平线给出。所有在血清读取前开始膜起泡的细胞最终都死亡了。相比之下，所有在取血清时尚未开始起泡的观察到的细胞存活并继续分裂（未显示）。
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引用人

  • 基于发光的细胞凋亡评估的当前趋势。
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  • 劫持稳态：细胞凋亡对肿瘤微环境的调节。
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