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.1996年12月10日;93(25):14559-63.
doi:10.1073/pnas.93.25.14559。

BAX诱导的细胞死亡可能不需要白细胞介素1β转化酶样蛋白酶

附属公司

BAX诱导的细胞死亡可能不需要白细胞介素1β转化酶样蛋白酶

J Xiang先生等。 美国国家科学院程序. .

摘要

在没有其他死亡刺激的情况下,BAX的表达足以诱导共同的凋亡途径。这包括通过裂解内源性底物聚(ADP核糖)聚合酶和D4-GDI(rho家族的GDP解离抑制剂)以及荧光肽乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-氨基三氟甲基香豆素(DEVD-AFC)激活白细胞介素-1β转化酶(ICE)样蛋白酶。抑制剂苄氧羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮(zVAD-fmk)成功阻断了这种蛋白酶活性,并阻止了FAS诱导的死亡,但没有阻止BAX诱导的死亡。阻断ICE样蛋白酶活性阻止了核底物和胞质底物的切割以及BAX诱导后的DNA降解。然而,BAX下游的线粒体膜电位、活性氧生成、细胞质空泡化和质膜通透性仍在下降。因此,BAX诱导的线粒体功能改变和随后的细胞死亡显然不需要已知的ICE-like蛋白酶。

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图1
图1
BAX诱导Jt-BAX细胞凋亡。(A类)用强力霉素(Sigma)培养Jt-Bax-21细胞每次1μg/ml。BAX表达通过用抗BAX抗体651进行免疫印迹分析。行李水平没有远远大于稳定克隆中获得的结果。(B类)碘化丙啶测定细胞活力排除。Jt-Bax-13和-21是两个独立的Jt-Bax克隆,而Jt-H是一个含有对照克隆的空载体。(C类)用抗FAS抗体(100 ng/ml,Upstate Biotechnology)4小时或强力霉素(1μg/ml)20小时或不治疗(对照组)。可见凋亡细胞核H33258或H33258+dUTP-菁-3-TdT-TUNEL(Cy3)。带有的单元格蓝色或蓝色加上粉红色碎裂和浓缩的细胞核代表凋亡细胞。
图2
图2
Jt-Bax细胞中ICE-like蛋白酶的激活。(A类)用强力霉素或有无抗FAS抗体(实心圈)方形和菱形)zVAD-fmk(50μM,酶系统产品)。内燃机使用荧光底物测量CPP32样活性YVAD-AFC和DEVD-AFC。(B类)用免疫印迹分析法检测ICE样蛋白酶用密度计扫描显示和定量抗体(Ultroscan XL),使用β-肌动蛋白作为对照。凋亡的PARP降解(C类)或D4-GDI(D类)曾经免疫印迹分析。p85,PARP凋亡片段;p20,D4-GDI凋亡片段;多西环素;F、,抗FAS抗体。
图3
图3
zVAD-fmk阻止DNA片段,但不阻止细胞BAX诱导后死亡。(A类)Jt-Bax-21细胞为与强力霉素(1μg/ml)孵育24小时,或无zVAD-fmk(50μM)。DNA片段(<2N个DNA)和细胞存活率(碘化丙啶除外)测量如下描述(1)。(B类)处理Jt-H和Jt-Bax-21细胞用抗FAS抗体(100 ng/ml)或强力霉素(1μg/ml)分别持续20小时zVAD-fmk公司。用电子显微镜分析细胞的超微结构显微镜检查。
图4
图4
线粒体膜电位降低(ΔΨm)和BAX诱导后ROS的产生。(A类)用强力霉素处理Jt-Bax-21细胞的指定时间为时间。1×10等份6细胞与50 nM 3,3′-二己基氧羰基碘[DiOC6(3)], 2μM氢乙硫胺或5μM DCFH-DA,并通过细胞荧光法进行分析。百分比反映了ΔΨm[DiOC的减少6(3) ](左侧)ROS生产(氢乙硫胺转化为埃塞俄比亚)(中部)和过氧化物(DCFH)的生产(). 数据代表了三个实验。DCFH面板中0小时的开放峰值为阳性对照10毫米高202治疗。(B类)Jt-Bax公司用Dox(1μg/ml)或抗FAS抗体(100ng/ml),在有或无50μM zVAD-fmk的情况下持续24小时。这个ΔΨm的减小(左侧)和ROS生产()如上所述进行测量。
图5
图5
BAX诱导细胞凋亡的示意模型。类ICE蛋白酶依赖和独立的途径可能是并行或顺序。

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引用人

参考文献

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