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比较研究
.1996年12月1日；16(23):7513-25.
doi:10.1523/JNEUROSCI.16-23-07513.1996。

早老素1和2（PS1和PS2）在人和小鼠组织中的表达

M K Lee先生1, H H泥浆, L J马丁, G Thinakaran公司, G金, S E甘地, M Seeger先生, E Koo公司, D L价格, S S西索迪亚
附属公司
比较研究

早老素1和2（PS1和PS2）在人和小鼠组织中的表达

M K Lee先生等。 神经科学. .

摘要

编码相关蛋白的基因突变，称为早老蛋白1（PS1）和早老蛋白2（PS2），与大多数早发家族性阿尔茨海默病（FAD）患者有关。为了阐明早老素的潜在功能以及早老素表达与AD发病的关系，我们检测了人和小鼠中PS1和PS2 mRNA及PS1蛋白的表达。逆转录RNA半定量PCR（RT-PCR）分析表明，PS1和PS2 mRNA在大多数人和小鼠组织中普遍表达，且表达水平相当，包括成人大脑。然而，PS1 mRNA在发育中的大脑中的表达水平明显较高。小鼠胚胎的原位杂交研究显示，PS1 mRNA的广泛表达具有神经表达模式，部分与编码特定Notch同源物的mRNA重叠。成年小鼠脑内原位杂交分析显示，PS1和PS2 mRNA富集于海马结构和内嗅皮层的神经元中。尽管PS1和PS2 mRNA在神经元中表达最为显著，但在白质胶质细胞中也检测到PS1和PS2转录物水平较低但意义重大。此外，培养的神经元和星形胶质细胞表达PS1和PS2 mRNA。在免疫印迹分析中使用PS1特异性抗体，我们证明PS1在大脑中累积为大约28 kDa N末端和大约18 kDa C末端片段。小鼠脑的免疫细胞化学研究表明，PS1蛋白在多种神经元群中积累，并在体皮层和神经膜室中富集。

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数字

图1。
图1。
人脑和小鼠脊髓中PS1和PS2 cDNA的定量PCR扩增。A类，EtBr染色凝胶Pfl公司MI/Nco公司我在22、24、26、28和30个扩增周期后，从人胎脑和成年小鼠脊髓cDNA中提取双消化PCR产物。还显示了使用PS1和PS2 cDNA作为模板获得的PCR产物。标记DNA片段以bp表示。B类，凝胶的放射自显影A类.C、 D类，人体放射性（密度）与循环数的半对数图(C类)和鼠标(D类)PS1和PS2片段如所示B类每个图的线性回归方程如插入.
图2。
图2。
人和小鼠组织中PS1和PS2 mRNA的RT-PCR分析。A类，EtBr染色凝胶Pfl公司密歇根州/Nco公司I通过RT-PCR扩增人类胎儿组织（肾上腺、肾脏、肝脏、肺、骨骼肌和脾脏）、胎儿和成人大脑（胎儿皮质）的RNA生成的双消化PCR产物(f-Ctx格式)，19岁(Ctx-19型)，66岁(Ctx-66型)和一位75岁的老人(Ctx-75型)]，皮层白质(WM-1型和WM-2型)和皮层灰质(GM-1公司和GM-2).B类，EtBr染色凝胶Pfl公司密歇根州/Nco公司小鼠胚胎RNAs RT-PCR扩增产生的双消化PCR产物【胚胎期8.5天】(E8.5段), 10.5 (E10.5级), 12.5 (图12.5)和14.5(图14.5)]，大脑[新生儿皮层(P1 Ctx)和成人皮层(广告Ctx)]和成人组织[心脏、肾脏、肝脏、肺、小肠(Sm Int公司)、脾脏和睾丸]。C、 D类，凝胶的放射自显影A类和B类分别是。PS1和PS2 cDNA产物的比率（两个独立PCR反应的平均值）显示在底部模板（反转录RNA）的量与其肌动蛋白mRNA含量相等（数据未显示）。
图3。
图3。
现场小鼠胚胎中PS1 mRNA的定位。对小鼠胚胎石蜡包埋切片进行处理现场通过PS1特异性核糖探针进行杂交。切片上的银颗粒代表特定的杂交，通过暗场显微镜观察到。拍摄与反义和对照感测探针杂交的切片，并在相同条件下进行复制。A、 B类，PS1 mRNA在E10小鼠胚胎中的表达。反义探针检测E10小鼠胚胎切片(A类)和感觉(B类)小鼠PS1核糖探针显示整个胚胎中存在PS1 mRNA。A类，主动脉；C类、脊髓；H（H），心脏；M（M），中脑；O（运行），视小泡；S公司，体节；装货单，横隔；T型，端脑。C、 D类，脊髓神经管的详细视图，如所示A类和B类.防冻段(C类)与用感测探针探测的断面相比，整个神经上皮的颗粒密度更高(D类).DRG公司，背根神经节；M（M）边缘带；V（V），心室区；VH公司，腹角。E、 F类反义杂交E12.5小鼠胚胎的矢状面切片(E类)和感觉(F类)小鼠PS1核糖探针显示PS1 mRNA在整个神经系统和外周组织中表达。B类，臂弓；C类、脊髓；H（H），心脏；HB公司，后脑；L（左）、肝脏；M（M），中脑；T型，端脑。G、 H（H），E16.5小鼠胚胎切片显示小肠上皮细胞中PS1 mRNA高水平表达(G公司)和皮肤(H（H）).比例尺：C、 D类150微米；G、 H（H），300微米。
图4。
图4。
APP、PS1和PS2转录物在小鼠大脑中的表达。成年小鼠背海马水平脑冠状切片与APP特异反义核糖探针杂交(A类)，PS1(C类)和PS2(E类).相邻切片用感测探针杂交(B、 D、F)显示反义探针的特异性。用暗场显微镜观察与特定转录物相关的银颗粒。在相同条件下拍摄并复制反义和相应的感觉控制切片。A、 B类，APP mRNA在大多数脑区高表达，尤其在海马CA区高表达(CA1、CA2)和初级嗅觉皮层(POC公司).APP切片暴露于乳液中3天。PS1(C、 D类)和PS2(E、 F类)mRNA分布广泛，但表达高(图图例（续）每个成绩单的级别都受到限制。将PS1和PS2切片暴露在乳胶上3周。与PS2探针杂交的切片的摄影需要更长的曝光时间(E、 F类)因为图中所示部分的信号电平较低E类在暗场照明下暴露时间越长，两种反义白质束相关的非特异性信号水平越高(E类)和感觉(F类)-探测截面。CA1、CA2,D类海马CA-区和齿状回；POC公司初级嗅皮层；Th（第个）丘脑；a、 b条,c（c）外侧、内侧和皮质杏仁核；d日弓状核；e（电子）丘脑底核；（f）插入带；g胼胝体；小时，缰绳。
图5。
图5。
大脑中PS1 mRNA的神经元和胶质细胞表达。A、 B类、反义杂交切片海马CA2区亮场图像(A类)或感觉(B类)PS1核糖探针。PS1 mRNA相关银颗粒的高水平在锥体神经元中最为明显。C、 D，脑切片胼胝体与反义杂交(C类)或感觉(D类)核糖探针显示白质束胶质细胞中PS1 mRNA的表达。通过微分干涉对比显微镜观察银颗粒，如图所示白点用苏木精/伊红对所有切片进行轻微复染。比例尺：A、 B类75微米；C、 D类，150微米。
图9。
图9。
PS1和PS2在培养的小鼠神经元和胶质细胞中的表达。A类从小鼠神经元或胶质RNA扩增的PS1和PS2产物的EtBr染色凝胶Pfl公司惯性矩。车道1，PS1质粒；车道2，PS2质粒；车道3，小鼠新皮层；车道4原代神经元培养；车道5原代胶质细胞培养。标记碎片(M（M）)以bps表示。B类、小鼠皮层总SDS-提取物（50μg）的免疫印迹分析(Ctx公司)，培养的神经元(N)和培养的胶质细胞(G公司)使用Ab14和αPS1Loop抗体；为了分析β3-微管蛋白和GFAP，测定了5μg总SDS-提取物。用PS1 N端片段抗体探测的斑点(抗体14)或PS1 C末端片段(αPS1回路)表明表达的PS1蛋白在培养的神经元和胶质细胞中以加工片段的形式积累。使用神经元特异性β-微管蛋白抗体对平行提取物进行免疫印迹分析(β3-微管蛋白)或GFAP(GFAP公司)证明了每种文化的纯洁性。分子量标准以kDa表示。
图6。
图6。
APP、PS1和PS2 mRNA表达在尾状体和内嗅皮质水平的分布。A–C，海马前水平的尾状壳核冠状切片，与APP特异反义核糖探针杂交(A类)，PS1(B类)，或PS2(C类)在外侧杏仁核中，APP mRNA相对于PS1和PS2转录物高水平表达。还需要注意的是，尽管尾状壳核中PS1 mRNA的水平在质量上与本节中的其他皮层区域相似，但相对于邻近的皮层区域，PS2 mRNA在CP中更为突出。人物配对关系尾壳核；HT（高温）下丘脑；洛杉矶、外侧杏仁核、，POC公司初级嗅皮层；Th（第个），丘脑。D–F型内嗅皮质水平经尾海马冠状切面(欧盟委员会)黑质(序号)与APP特异性反义核糖探针杂交(D类)，PS1(E类)和PS2(F类).所有三种转录物均分布在整个冠状切片中，海马、内嗅皮层和杏仁核中APP、PS1和PS2 mRNA显著表达。在SN神经元中APP mRNA水平很高，而PS1和PS2 mRNA在SN及其邻近区域的表达水平相似。A类，杏仁体；CA1公司,CA3类海马CA-区；D类，齿状回；M（M），乳头体。
图7。
图7。
小脑中PS1和PS2 mRNA的表达。A、 C类PS1反义核糖探针杂交小脑和脑桥矢状断面的暗场显微镜图像(A类)和PS2(B类).B、 D类，小脑皮质高倍镜显示PS1(B类)和PS2(D类)颗粒细胞层上与mRNA相关的银颗粒(gcl公司)和浦肯野细胞(箭头)Purkinje细胞层(多氯联苯).请注意多氯联苯不限于浦肯野细胞和分子层中的细胞(毫升)也表现出特异性杂交。比例尺，B、 D类，75微米。
图8。
图8。
处理过的PS1片段在小鼠组织中的积累。小鼠神经（嗅球，车道1；尾状壳核，车道2；丘脑，车道3；新皮质，车道4；海马体，车道5；小脑，车道6；脑干，车道7；视神经，车道8)和非神经（心脏、，9号车道；肾脏，10号车道；肝脏，11号车道；肺，12号车道；小肠，13号车道；脾脏，车道14)用PS1特异性抗体14对组织进行免疫印迹和探测(A类)或αPS1Loop(B类)抗体。箭头表示与肽竞争的特异性免疫反应物种(抗体14)或GST融合蛋白(PS1回路；Thinakaran等人，1996年）（未显示数据）。全长PS1的预测迁移率由星号分子质量标准见左边单位：kDa。A类，Ab14在～28–30 kDa与N末端PS1片段反应。注意，在神经组织中(1–8车道)，PS1 N末端片段分解为一个主要双链体和一个迁移迟缓的次要物种(箭头).除了肺(12号车道)，在非神经组织中仅检测到一个Ab14-反应性PS1片段(9–14车道).B类，αPS1Loop抗体与所有组织中的～18kDa PS1片段特异性反应。
图10。
图10。
PS1在小鼠脑内的免疫组织化学定位。A类新皮质αPS1Loop染色。PS1-IR存在于新皮质的所有层。盒子以更高的放大倍数描绘显示的区域B类.比例尺，160μm。B类，新皮质αPS1Loop染色高倍镜。PS1-IR在神经元的体脂细胞间隔中富集，在神经膜中染色较浅。比例尺，53μm。C类αPS1Loop抗体与GST-PS1 loop融合蛋白的预吸附可完全竞争体细胞树突状细胞和神经细胞PS1-IR。比例尺，160μm。D类海马结构中的αPS1Loop染色。PS1-IR存在于CA1公司,CA3类和齿状回(DG公司).锥体神经元的胞体CA1公司和CA3类和颗粒细胞的DG公司强烈的PS1-IR。此外，透明层(SL公司)第页，共页CA3类对应于来自颗粒细胞的苔藓纤维的末端场DG公司，也是强烈的PS1-IR。比例尺，320μm。E类，αPS1Loop染色放大倍数更高CA1公司PS1-IR在锥体层神经元胞体中显著(服务提供商)辐射层中的近端树突(SR公司).比例尺，64μm。F类，αPS1Loop染色放大倍数更高CA3类PS1-IR存在于服务提供商并且在SL公司.比例尺，160μm。G公司海马结构中的Ab14染色。PS1-IR与使用αPS1Loop抗体相似。比例尺，280μm。
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工具书类

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