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.1996年9月1日;333(1):251-9.
doi:10.1006/abbi.1996.0388。

酵母C1四氢叶酸合成酶推定的10-甲酰基四氢叶酸结合位点中高度保守天冬氨酸的定点突变

附属机构

酵母C1-四氢叶酸合成酶10-甲酰-四氢叶酸结合位点中高度保守的天冬氨酸的定点突变

T J柯克西等。 Arch Biochem生物物理. .

摘要

C1-四氢叶酸(THF)合成酶是一种真核三功能蛋白,具有10-甲酰-THF合成酶、5,10-甲苯基-THF环水解酶、5,10-亚甲基-THF脱氢酶的活性。虽然10-甲酰基-THF合成酶反应(一种可逆的ATP-依赖的THF甲酰化反应)已被广泛研究,但对催化机理中涉及的特定残基知之甚少。在本研究中,我们检测了酵母胞质C1-THF合成酶的高度保守的天冬氨酸残基Asp449的作用。Asp449是在许多结合10-甲酰-THF的蛋白质中发现的假定叶酸结合位点的一部分。相应的天冬氨酸已被确定为大肠杆菌和人GAR转化酶中的关键催化残基,它催化10-甲酰基-THF-依赖甲酰基转移。为了确定Asp449在10-甲酰-THF合成酶反应中是否具有类似的催化作用,通过定点突变产生了三种突变蛋白,其中酵母胞质C1-THF合酶的Asp449-被改变为Asn、Glu或Ala。突变蛋白在酵母中表达,纯化,并具有动力学特性和酶稳定性。所有三种突变酶都保留了大量的10-甲酰-THF合成酶活性,表明Asp449不是一种关键的催化残基。然而,我们的数据表明,它确实在叶酸结合中发挥作用,可能是通过促进活性位点的正确构象。因此,这些结果表明,GAR转化酶和10-甲酰-THF合成酶家族之间的10-甲酰基-THF结合位点存在显著差异,并且保守的天冬氨酸在这两种酶中起着不同的作用。

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