Voltage-gated K+ channel beta subunits: expression and distribution of Kv beta 1 and Kv beta 2 in adult rat brain

doi:10.1523/JNEUROSCI.16-16-04846.1996

.1996年8月15日；16(16):4846-60.

doi:10.1523/JNEUROSCI.16-16-04846.1996。

电压门控K+通道β亚单位：Kvβ1和Kvβ2在成年大鼠脑中的表达和分布

K J罗兹¹, M M Monaghan先生, N X巴雷佐埃塔, S纳沃希克, Z贝克勒·阿库里, M F马托斯, K纳卡希拉, L E Schechter公司, J S微调器

附属公司

PMID： 8756417
预防性维修识别码： PMC6579302型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.16-16-04846.1996

电压门控K+通道β亚单位：Kvβ1和Kvβ2在成年大鼠脑中的表达和分布

K J罗兹等。神经科学. 1996.

.1996年8月15日；16(16):4846-60.

doi:10.1523/JNEUROSCI.16-16-04846.1996。

作者

K J罗兹¹, M M Monaghan先生, N X巴雷祖塔, S纳沃希克, Z贝克勒·阿库里, M F马托斯, 中平K, L E Schechter公司, J S微调器

附属

¹美国新泽西州普林斯顿市Wyeth-Ayerst Research，CNS疾病，邮编：08543。

PMID： 8756417
预防性维修识别码： PMC6579302型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.16-16-04846.1996

摘要

最近对K+通道β亚基的克隆表明，这些细胞质多肽可以显著改变当前失活的动力学，并促进通道形成α亚基的有效糖基化和表面表达。在这里，我们检测了这两种β亚单位中Kvβ1和Kvβ2在成年大鼠大脑中的表达、分布和关联。使用cRNA探针的原位杂交显示，这些β亚基基因是异质表达的，纹状体、海马CA1亚区和小脑浦肯野细胞中有高密度的Kvβ1mRNA，大脑皮层、小脑和脑干中有高密度的Kvβ2mRNA。使用亚单位特异性单克隆抗体和亲和纯化的多克隆抗体进行免疫组织化学染色显示，Kvβ1和Kvβ2多肽经常共存，并集中在神经元胞体周、树突和终末区，以及有髓轴突的近帕帕诺尔区。免疫印迹和相互免疫共沉淀分析表明，Kvβ2是大鼠脑细胞膜中的主要β亚单位，大多数含有Kvβ1的K+通道复合物也含有Kv beta 2。综上所述，这些数据表明，Kvβ2是几乎所有包含Kv 1α亚单位的K+通道复合体的组成部分，并且单个通道可能包含两个或更多生化和功能不同的β亚单位多肽。

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数字

**图1。**
成年大鼠脑内Kvβ1和Kvβ2 mRNA的表达。大鼠大脑的水平和冠状切片由就地杂交组织化学定位Kvβ1(A类,B类,E类–*G公司*)和Kvβ2(C类,D类,*H（H）*–J型)mRNA。在这些明亮的图像中，含有高密度杂交信号的区域看起来很暗。中的自动放射自显影A类–D类暴露3d，而E类–J型暴露7d。在较短的曝光时间内，表达水平的细微差异更容易识别。例如，与邻近的CA3亚区相比，海马CA1亚区的Kvβ1 mRNA密度相对较高(B类).CA1公司海马亚区；*CB（断路器）*，小脑；*CPu（中央处理器）*尾状壳核；*欧盟委员会*内嗅皮层；*注册护士*，红色细胞核；毫秒内侧隔核；*AN公司*丘脑前核；*医学博士*丘脑内侧核。

**图2。**
Kvβ1和Kvβ2 mRNA表达的细胞定位。制备乳剂放射自显影图以定位单个细胞内的Kvβ1和Kvβ2 mRNA。含有高密度mRNA的细胞含有相应高密度的银颗粒，其表现为亮点在这些暗场图像中。在后扣带回皮层（23区），Kvβ1 mRNA(A类)在第II层和第III层的许多小细胞和第V层的大细胞中高度表达(箭头)，而Kvβ2(B类)主要在第二层的小细胞和第五层的大细胞中表达(箭头). 在内嗅皮层，Kvβ1 mRNA(C类)在第II、III、V和VI层的大小细胞中表达，而Kvβ2 mRNA(D类)在第二层细胞中以高密度表达，在该结构的其余层细胞中密度较低。在尾状核中，Kvβ1的表达水平很高(E类)Kvβ2表达水平较低(F类)几乎在所有细胞中(箭头). 穿过该结构的有髓轴突束不包含杂交信号(箭头). 在基底前脑，Kvβ1(*G公司*)和Kvβ2(*H（H）*)mRNA在大细胞中表达(箭头)具有该区域大胆碱能神经元的分布和频率特征。这个*短箭头*在里面*G公司*和*H（H）*标记大脑的中线。

**图3。**
大鼠脑膜和转染COS-1细胞中Kvβ1和Kvβ2β亚基多肽的免疫印迹分析。粗大鼠脑膜(*成果管理制*)（50μg）和转染Kvβ1/RBG4的COS-1细胞的洗涤剂提取物(*Kvβ1*)，Kvβ2/RBG4(*Kvβ2*)或单独使用RBG4(矢量)在12.5%十二烷基硫酸钠凝胶上分级，转移到硝酸纤维素上，用兔抗Kvβ1多克隆抗体以1:50的比例探测所得免疫印迹(左边)或小鼠抗Kvβ2单克隆抗体K17/70组织培养上清液纯(*正确的*). 使用ECL显示信号(左边30分钟；*正确的*，1分钟）。数字在左边指预应变分子量标准的流动性。

**图4。**
抗体特异性分析。COS-1细胞中表达的Kvβ1和Kvβ2β亚基的免疫荧光染色。用Kvβ1/RBG4转染COS-1细胞(A类–D类)或Kvβ2/RBG4(E类–*H（H）*)cDNA。然后将转染细胞固定、渗透并与兔抗Kvβ1多克隆抗体以1:100的比例孵育(A类,E类)，兔抗Kvβ2多克隆抗体1:200(B类,F类)，小鼠抗Kvβ1单克隆抗体K9/40，1:2(C类,*G公司*)，或小鼠抗Kvβ2 mAb K17/70，1:2(D类,*H（H）*). 然后将细胞与德克萨斯州红结合抗兔培养(A类,B类,E类,F类)或防鼠(C类,D类,*G公司*,*H（H）*)二级抗体。

**图5。**
大鼠脑内Kvβ1和Kvβ2的存在⁺通道复合体。成年大鼠脑膜样品(*成果管理制*)500μg RBM洗涤剂提取物与Kvβ1和Kvβ2特异性多克隆抗体的免疫沉淀反应产物（60μg）和等分样品(泛β，1:100），Kvβ1(*抗Kvβ1*，1:200），Kvβ2(*抗Kvβ2*，1:500）或Kv2.1α亚基(*抗Kv2.1*，1:200）通过12.5%SDS-PAGE进行粒度分级。将样品转移到硝酸纤维素中，并用兔抗Kvβ1多克隆抗体以1:50进行探测(*左侧面板*)，小鼠抗Kvβ2单克隆抗体K17/70纯(*中间面板*)或1:100的兔抗Kv1.2多克隆抗体(*右侧面板*). ECL检测到结合抗体-放射自显影40分钟(*左侧面板*)或3分钟(*中间的*和*右侧面板*).箭头指免疫沉淀反应中使用的兔免疫球蛋白重链多肽和相应K的流动性⁺通道多肽；数字在左边面板的数量表示*M（M）*_第页预处理分子量标准。～50 kDa的频带(左边和*右侧面板*)是用于免疫沉淀的兔IgG重链，与抗兔二级抗体反应，但与抗鼠二级抗体不反应。

**图6。**
大脑皮层和纹状体中Kvβ1和Kvβ2的免疫组织化学定位。在顶叶皮层，Kvβ1（K9/40 mAb）的免疫反应性(A类)集中在V层的大锥体细胞和小中间神经元中(箭头)主要集中在第II层和第III层。Kvβ2的免疫反应性（亲和纯化多克隆抗体）(C类)集中在V层锥体细胞的胞体和顶端树突中。含有高密度Kvβ1免疫反应的小中间神经元含有低密度Kvα2免疫反应。纹状体中Kvβ1的免疫反应密度很高(B类)和Kvβ2(D类)苍白球(*普通合伙人*)尾状核密度较低(光盘). 在苍白球中，Kvβ1和Kvβ2的免疫反应主要集中在终末区，并存在于肌上和肌下节段。*自动控制*，前连合。

**图7。**
中脑和小脑中Kvβ1和Kvβ2的免疫组织化学定位。在中脑，Kvβ1（K9/40 mAb）的免疫反应性(A类)和Kvβ2（亲和纯化多克隆抗体）(C类)集中在黑质网状部的终末区(*信噪比*)在红核的大神经元中(*注册护士*). 在小脑皮层，Kvβ1的免疫反应(B类)和Kvβ2(D类)集中在浦肯野细胞的胞体中(*P（P）*)以及整个分子层的终端场。Kvβ2的免疫反应性也集中在Purkinje细胞的树突和篮形细胞的轴突终末，形成一个特征性的突触丛(箭头)其终止于浦肯野细胞轴突的起始段。

**图8。**
大鼠脑内β-亚基关联的假设模型。大鼠大脑β亚基总库至少包含三种β亚基亚型*Kvβ1*,*Kvβ2*、和*KvβX*在这个维恩图中。使用Kvβ2特异性抗体观察到的免疫反应性几乎概括了使用泛β抗体显示的整个免疫反应模式和范围（Rhodes等人，1995年⁺通道复合体。相反，Kvβ1的免疫反应存在于小比例的泛β/Kvβ2免疫反应结构中。由于包含在泛β抗体中的C末端表位存在于所有克隆的Kvβ亚单位中，因此这些β亚单位亚型（指定为*KvβX*)也将与全脑β-亚基复合物的一个子集相关，即也包含Kvβ2的复合物。

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