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比较研究
.1995年9月15日;270(37):21852-9。
doi:10.1074/jbc.270.37.21852。

通过定点突变揭示的蛋白激酶Cδ第二个富含半胱氨酸区域中与佛波酯结合相关的残基

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比较研究

通过定点突变揭示的蛋白激酶Cδ第二个富含半胱氨酸区域中与佛波酯结合相关的残基

M G Kazanietz公司等。 生物化学杂志. .
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摘要

福尔波酯与蛋白激酶C(PKC)同工酶以及两种新型受体n-奇马林和Unc-13具有高亲和力。这些蛋白质中富含半胱氨酸的区域被确定为佛波酯肿瘤启动子和亲脂第二信使sn-二酰基甘油的结合位点。一种50氨基酸肽,包含PKCδ的第二个富含半胱氨酸区域,在大肠杆菌中表达为谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,结合具有高亲和力(Kd=0.8 nM)的[3H]佛波醇12,13-二丁酸酯(PDBu)。以富含半胱氨酸区域的cDNA为模板,通过定点突变产生了一系列37个点突变,并对突变蛋白进行了定量分析,以确定其与[3H]PDBu的结合,以及在适当情况下与超高效类似物[3H]bryostatin 1的结合。突变体表现出三种行为模式之一:佛波酯结合被完全取消,结合亲和力降低,或结合没有显著改变。正如预期的那样,六个半胱氨酸中的五个以及参与Zn2+配位的两个组氨酸对于蛋白质与佛波酯的相互作用是关键的。此外,几个位置的突变,包括苯丙氨酸3、酪氨酸8、脯氨酸11、亮氨酸20、21和24、色氨酸21、谷氨酰胺27和缬氨酸38,大大减少了与配体的相互作用。这些突变的影响可以从富含半胱氨酸区域的三维(NMR)结构中合理化。特别是,蛋白质的C末端部分似乎不是必需的,包含氨基酸20到28的环与结合活性有关。

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