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.2022年5月；9（14）：e2103241。
doi:10.1002/advs.202103241。 Epub 2022年3月14日。

器官芯片中异位淋巴滤泡形成和人类季节性流感疫苗接种反应综述

吉里贾·戈亚尔 1, 普拉纳夫·普拉巴拉 1, 乔塔姆·马哈扬 1, 布鲁斯·鲍斯克 1 2, 塔尔·吉尔博亚 1 2, 谢良霞 1 2, 翟云浩 1, 罗伊·拉扎罗维茨 1, 亚当·曼苏尔 1, 闵孙金 1, 阿迪蒂亚·帕蒂尔 1, 丹妮尔·柯兰 1, 杰琳·M·朗 1, 同意聘任桑杰 1, 阿比迪米·朱奈德 1, 利莫·科恩 1 2, 托马斯·费兰特 1, 奥伦·利维 1, 蕾切尔·普兰蒂尔·鲍恩 1, 大卫·R·沃尔特 1 2, 唐纳德·英格勃 1 三 4
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器官芯片中异位淋巴滤泡形成和人类季节性流感疫苗接种反应综述

吉里贾·戈亚尔等。 高级科学（Weinh）. 2022年5月.

摘要

淋巴滤泡（LF）负责在次级淋巴器官中产生适应性免疫反应，并在慢性炎症期间在外周形成。异位LF形成的人类模型将为了解LF的发展提供工具，并为疫苗的临床前评估提供非人类灵长类动物的替代品。这里显示，当在双通道芯片式有机微流体装置的一个通道内的3D细胞外基质凝胶中培养时，原始人类血液中的B和T淋巴细胞会自动聚集成异位LF。LF形成需要通过由微孔膜分隔的平行通道进行超融合，并防止淋巴细胞自动激活。这些生发中心样LF包含表达活化诱导胞苷脱氨酶的B细胞，并在活化后表现出浆细胞分化。为了探索其在季节性疫苗测试中的用途，将自体单核细胞衍生的树突状细胞整合到LF芯片中。与2D培养相比，人类LF芯片显示出对裂解病毒流感疫苗的抗体反应有所改善，而2D培养通过水包角鲨烯乳剂佐剂增强了抗体反应，这伴随着LF大小和数量的增加。当接种商业流感疫苗时，可以观察到血浆细胞的形成和抗血凝素IgG的产生，以及在临床相关时间尺度上与接种过疫苗的人相似的细胞因子的分泌。

关键词：抗体；生发中心；淋巴结；器官芯片；疫苗。

PubMed免责声明

利益冲突声明

D.E.I.是Emulate，Inc.的创始人、董事会成员、科学咨询委员会主席和股东。；G.G.和D.E.I.是相关专利申请的共同发明人。D.R.W.是Quanterix Corporation的创始人，拥有财务利益，并在其董事会任职。

数字

图1
图1
灌注诱导人类LF芯片中的卵泡形成。a） 用于制作人类低频芯片的2通道器官芯片设备的照片（顶部），红色染料填充下部微通道，该设备的横截面示意图（底部）显示了下部通道如何填充含有人类淋巴细胞的ECM凝胶，其通过多孔膜供给，所述多孔膜通过流过上部通道的介质来分离通道。b） ECM纤维（绿色）的二次谐波图像与人淋巴细胞Hoechst染色细胞核（品红色）的荧光图像相结合，这些细胞核在低频芯片下通道内保持的ECM凝胶中高密度生长，无论是在静态条件下（静态）还是在动态灌流条件下（流动；箭头指示方向）（bar，30µm）。c）量化在器官芯片中静态（静态）培养或主动灌注（流动）培养4天的3D ECM凝胶中的LF数（卵泡#）和体积（卵泡体积）。不同颜色的数据点表示不同的捐献者(n个=6），每个点表示>2个芯片的每个视野中的卵泡数（左）。在静态或流动下观察到的每个卵泡的体积是针对一个具有代表性的供体（右）报告的。另外两名捐赠者的卵泡大小也存在类似差异。误差条表示标准偏差（SD）；*，第页<0.05使用未配对学生的吨使用韦尔奇修正进行测试。d） 使用Simoa分析，在存在或不存在SAC抗原的情况下培养4或8天的LF芯片流出物中检测到分泌的CXCL13蛋白。不同颜色的数据点表示不同的捐赠者(n个=4），每个点代表一个单独的芯片。误差条表示SD；*，第页使用单向方差分析法进行<0.05，以确定Fisher LSD测试后的任何显著差异。e） 通过流式细胞术在同型对照组（左）、静态培养组（中）和灌注LF芯片（右）中评估B细胞CD27的表达。代表性结果显示一个供体的1个芯片，使用两个不同供体细胞的2个芯片获得了类似的结果；阳性峰中的细胞百分比显示在每个图中的CD27+下方。MFI显示在直方图的左上角。f） 通过ELISA测定的IgG水平（检测限=49 pg mL−1)并对静态培养（静态）和灌注LF芯片（流）的培养量进行标准化，每个芯片来自2名捐赠者(n个= 4). 误差条表示SD*第页<0.05使用未配对的学生吨使用韦尔奇修正进行测试。
图2
图2
B细胞保持静止，但在芯片上形成的LF中表达AID。a） 初始PBMC样本（PBMC；n个=3）与移植扁桃体（扁桃体；n个=2），或在LF芯片中培养4天的细胞（LF芯片；n个= 3). 正峰值中的细胞百分比显示在直方图上绘制的门的上方。b） 代表性共焦免疫荧光显微照片，显示在LF芯片中培养4天的b细胞中AID表达（绿色）（4名供体获得了类似的结果）；淋巴细胞中的Hoechst染色细胞核显示为蓝色。c） 定量分析培养4天的灌流器官芯片中从单个细胞大小的感兴趣区域到4个独立视野的大卵泡的183个颗粒中的AID表达水平，作为颗粒大小（颗粒面积）的函数绘制MFI图。每个数据点表示1个粒子和来自LF芯片的4个图像的粒子，所述LF芯片由所示的一个代表性供体创建。另外3名捐赠者也获得了类似的结果。显示了非参数Spearman相关性。
图3
图3
B细胞在LF芯片中表现出类别转换和血浆细胞形成。a） 在存在或不存在IL4和抗CD40 Ab的情况下培养6天后，用原始B细胞和体积T细胞构建LF芯片时，在LF芯片流出物中测得的总IgG生成量。每个点表示单个芯片的结果(n个=2）用来自两个供体（黑色和灰色）的细胞创建；*，第页<0.05使用未配对学生的吨使用韦尔奇修正进行测试。b） 免疫荧光显微照片显示未刺激LF芯片（无刺激）或经IL4和抗CD40 Ab处理的芯片中的细胞染色CD138（绿色）和细胞核（洋红色）；来自3个不同供体的细胞也获得了类似的结果。c） 同一LF芯片中单个细胞（灰色条）与LF内细胞（黑色条）CD138表达的定量。误差条表示SD，基于对来自1名供体的5个随机选择的字段的分析，包含来自3名不同供体细胞的LF芯片也获得了类似的结果。*，第页<0.05，使用双向方差分析确定任何显著差异，然后进行Fisher LSD测试。d） SAC处理的LF芯片中CD138（绿色）和细胞核（品红色）的免疫染色（3个供体获得的类似结果；bar 100µm）。e）CD138水平测量为灌注器官芯片中ECM凝胶内孤立细胞（单细胞）与滤泡细胞（LF）中CD138标记投影面积的%。显示的结果来自于从一个供体细胞创建的1个LF芯片中随机选择的5个字段，以及从3个不同供体细胞获得的类似结果。误差条表示SD*第页<0.05使用未配对学生的吨使用韦尔奇修正进行测试。f） 用SAC处理3天后，在LF芯片流出物中测量总IgG水平。每个彩色圆点表示来自3个不同捐赠者中每个捐赠者的一个芯片的结果。误差条表示平均值的标准误差（SEM）；第页<0.05使用未配对的学生吨‐测试。
图4
图4
疫苗和佐剂诱导人类LF芯片中的抗体生成和卵泡形成。a） 当未经刺激（培养基）或仅用H5N1抗原（H5N1）或SWE（+SWE）刺激时，使用Simoa数字ELISA在LF芯片（芯片）流出物或2D培养（2D）中保存9天的细胞培养基中检测到抗-HA抗体信号。每个数据点表示一个井或芯片；不同颜色的点表示来自4个独立捐赠者的芯片或孔。显示抗-HA Ab信号>LOD的总样本比例如上述各点文字所示。Simoa值表示为每粒平均酶（AEB），误差条表示SD。统计差异采用Kruskal‐Wallis检验，然后采用未修正的Dunn检验进行配对检验）；第页< 0.05. b） 3D共焦显微叠加视图显示，在不含或含有SWE佐剂（H5N1+SWE）的情况下接种H5N1流感裂解抗原（H5N1）时，在灌注LF芯片内培养3天的ECM凝胶内存在假彩色滤泡（灰色）和细胞核（绿色）；巴，50µm。c） 图中显示了LF芯片中观察到的滤泡数量（左）和大小（右）的量化，LF芯片由4个不同供体的细胞生成，用不同颜色的符号表示。每个数据点指示一个视场（毛囊#，n个>26）或单个卵泡（卵泡体积。，n个> 30); 误差条指示SD*，p<0.05使用未配对学生的吨使用韦尔奇修正进行测试。d） 显示用来自两个不同供体（开放和填充正方形）的细胞生成的LF芯片中观察到的CD138+区域的量化图；每个数据点表示一个视野*第页<0.05，使用Brown‐Forsythe单向方差分析，然后使用未配对吨使用韦尔奇校正对不相等方差进行测试。
图5
图5
人LF芯片中的流感体外接种。a） 接种Fluzone后9天，LF芯片流出物中针对Brisbane 59 H1N1毒株（anti-HA IgG）的抗-HA IgG水平的小提琴图，与扁桃体细胞接种培养物（扁桃体对照）中测得的水平相关，如使用数字ELISA检测到的。每个数据点代表用一个供体细胞（共测试了8个供体）创建的2-6个芯片的平均值。b） 使用含有来自高（★）和低（▼）代表性供体细胞的LF芯片，在培养5至12天的芯片流出物中测量抗HA IgG分泌的时间进程a.c）免疫荧光显微照片显示，在Fluzone刺激的包含高抗-HA抗体产生者细胞（细胞核，洋红）的LF芯片中，CD138染色（绿色）（3种不同的高抗体产生者供体获得了类似的结果；bar，100µm）。d）接种后9天，接种或不接种DC的LF芯片流出物中针对Brisbane 59 H1N1菌株的抗-HA抗体水平，通过数字ELISA检测，与扁桃体细胞培养物中测得的水平相关。显示了一个供体产生的一个芯片的3次重复测量的平均水平，用两个不同供体的细胞产生的LF芯片也获得了类似的结果。误差条表示SD；*，第页<0.05，使用未配对学生t检验和韦尔奇修正。e） 接种疫苗后5天，通过数字ELISA检测到LF芯片流出物中CXCL13的水平（有或无DC）。每个彩色圆点代表一个芯片，其中包含来自两个不同供体的细胞（黑色和红色圆点，n个≥ 3). 误差条表示SD；*，第页<0.05使用未配对学生的吨使用韦尔奇修正进行测试。f） 接种疫苗后第9天LF芯片流出物中针对布里斯班59 H1N1菌株的抗-HA抗体水平与第5天CXCL13水平相关。来自的结果5捐献者被显示，每个点代表一个单独的芯片(n个= 9); Graphpad Prism对CXCL13和IgG水平之间的非参数Spearman相关性进行了分析。g） 褶皱变化热图（Log2)细胞因子水平（IFN‐γ，IL-10，IL-2，GM‐CSF），使用数字ELISA测定5个不同供体细胞产生的LF芯片流出物中的IL-10，IL‐2，GM‐），接种疫苗后3天（C1‐5）与未接种芯片的比较，以及接种疫苗后1天7个人（V1，3，4，10–13）外周血中的水平与流行水平的比较。
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