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.2022年2月22日；16(2):1940-1953.
doi:10.1021/acsnano.1c05505。 Epub 2022年1月31日。

工程胞外囊泡对辐射引发的GBM免疫检查点的抑制作用

田田 1, 梁如玉 1, 古尔萨·埃雷尔·阿克巴巴 2, 洛伦佐·萨阿德, 皮埃尔·奥贝德 三, Jun Gao（高军） 1, E安东尼奥·乔卡 4, 斯莱德, 巴科斯A Tannous
附属公司

工程胞外囊泡对辐射引发的GBM免疫检查点的抑制作用

田田等。 美国化学会纳米. .

摘要

缺乏安全有效的跨血脑屏障递送和深刻的免疫抑制微环境是胶质母细胞瘤（GBM）治疗的两个主要障碍。细胞外囊泡（EV）被用作GBM的治疗载体，但疗效有限。我们假设，通过（i）用脑肿瘤靶向的环状RGDyK肽（RGD-EV）修饰EV表面，以及（ii）使用突发辐射增强积聚，可以增强EV向GBM的传递。此外，EV被加载小干扰RNA（siRNA）以对抗程序性细胞死亡配体-1（PD-L1），用于免疫检查点阻断。我们表明，这种基于EV的策略显著提高了RGD-EV对小鼠GBM的靶向效率，而负载的siRNA逆转了肿瘤细胞上受辐射刺激的PD-L1表达，并招募肿瘤相关的髓细胞，提供了协同效应。联合治疗显著增加CD8+细胞毒性T细胞活性，阻止肿瘤生长，延长动物生存期。所选择的用于EVs分离的细胞源和所提出的功能化策略适用于大规模生产。这些结果为GBM免疫检查点治疗提供了一种基于EV的治疗策略，可以转化为临床应用。

关键词：细胞外小泡；胶质母细胞瘤；免疫治疗；放射治疗；有针对性的交付。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1。
图1。
RGD-EV的修饰与表征。（A）ReN细胞及相应EV中Alix、TSG101的Western blot分析；EVs分离过程中通过超速离心获得的上清液用作阴性对照。（B） 通过两步反应将c（RGDyK）和Cy5.5荧光团偶联到EV胺基的示意图。未修改EV和RGD-EV的（C，D）NTA（C）和TEM成像（D）；比例尺，200 nm。
图2。
图2。
一系列RT引物GBM增强靶向RGD-EV的摄取。（A）Cy5.5标记RGD-EV的荧光图像；比例尺，2μm.（B，C）照射（或不照射）含云母的GBM，3天后注射Cy5.5标记的对照EV或RGD-EV。EV给药24小时后，小鼠大脑的典型NIRF图像（覆盖亮场）（B）。肿瘤区域荧光强度的定量（C）；数据表示为平均值±SEM(n个= 4); **P（P）< 0.01, ***P（P）通过单因素方差分析得出<0.001。（D） 照射GBM荷瘤小鼠并注射td番茄标记EVs或RGD-EV。EV给药后6h GBM（GFP）EVs（红色）的典型荧光图像；蓝色表示细胞核；比例尺，50μ米。
图3。
图3。
RT诱导GBM和免疫微环境中PD-L1的上调。（A） 放射和非放射肿瘤GL261脑肿瘤切片PD-L1（红色）和Hoechst细胞核（蓝色）染色后的荧光分析；比例尺，50μm.（B，C）流式细胞术分析RT（或对照）后GBM细胞和浸润免疫细胞（TAMC、TIL、小胶质细胞）中PD-L1的表达。PD-L1（B）和MFI（C）的代表性直方图。（D，E）根据GFP百分比确定的肿瘤细胞丰度量化+人口。（F） 不同免疫细胞（TIL、CD45）的门控策略高的CD11b型−; TAMC、CD45高的CD11b型+; 小胶质细胞，CD45整数CD11b型+)免疫细胞亚群的百分比。（G） 流式细胞术测定TAMC、TIL和小胶质细胞的相对细胞丰度。数据以平均值±SEM表示(n个= 6); *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001按学生t吨-测试。
图4。
图4。
RGD-EV:siPDL1靶向并下调以RT引物启动的GBM中的PD-L1。（A）RGD-EV示意图，Cy5.5标记，并负载胆固醇修饰的siPDL1。RGD-EV的（B，C）NTA（B）和TEM成像（C）：siPDL1；比例尺，200 nm。（D-E）用5-Gy RT引发的携带GL261肿瘤的小鼠注射Cy5.5标记的EVs或RGD-EV:siPDL1，并在24小时后分析脑中Cy5.5的水平。显示了具有代表性的脑部NIRF图像（D）和肿瘤区域荧光强度的量化（E）。数据表示为平均值±SEM(n个= 4); ***P（P）<0.001（按学生分类）t吨-测试。用RT和静脉注射PBS、携带siCtrl或siPDL1的靶向或非靶向EV对（F，G）GBM荷瘤小鼠进行预处理。48小时后，通过流式细胞术分析GBM细胞和TAMCs上PD-L1的表达，根据PD-L1百分比测定+种群（F）和PD-L1 MFI（G）。数据表示为平均值±SEM(n个= 6); **P（P）< 0.01, ****P（P）通过单向方差分析，<0.0001。
图5。
图5。
RGD-EV:siPDL1增加TIL CD8+RT爆发后GBM微环境中的T细胞。（a）GBM小鼠RT和EV治疗的实验流程示意图。在第21天采集脑肿瘤样本。（B，C）CD8的代表斑马图+/CD3（CD3）+CD8上的比率（B）和Ki67染色+T细胞（C）。（D） CD8（CD8）+T细胞丰度测定为CD8的百分比+CD3-CD8图中的子集乘以CD45的百分比+CD3（CD3）+，归一化为PBS对照组。（E） CD8的量化+/CD3（CD3）+比率。（F） 增殖百分比的量化（Ki67+)CD8（CD8）+T细胞。（G） 脑肿瘤（GFP）切片上CD8（红色）和细胞核（蓝色）的免疫染色；比例尺，50μm.数据表示为平均值±SEM(n个= 6); *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）通过单因素方差分析得出<0.001。
图6。
图6。
RGD-EV:siPDL1与RT协同促进CD8+GBM中的T细胞效应器功能。用RT和/或不同EV配方处理GBM荷瘤小鼠，从GBM微环境中提取浸润淋巴细胞，并在PMA和离子霉素的刺激下培养。（A） 描述IFN的代表性斑马图-γ、TNF-α和TIL CD8上Granzyme B的表达+GBM中的T细胞。（B）TIL CD8的定量+由IFN的百分比确定的T细胞效应器功能-γ+、TNF-α+和Granzyme B+人口及其MFI。数据表示为平均值±SEM(n个= 6); *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）通过单因素方差分析得出<0.001。
图7。
图7。
RGD-EV:siPDL1与RT协同增强GBM的免疫检查点阻断。用RT（或无辐射作为对照）刺激GBM荷瘤小鼠，72小时后，静脉注射PBS或不同EV（RGD-EV:siPDL2，RGD-EV-siCtrl，scr-EV-siPDL1）。（A） 各组代表性小鼠的Fluc生物发光成像随时间变化。（B） 用平均值±SEM表示的数据量化肿瘤相关Fluc辐射强度**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001，通过单向方差分析。（C） Kaplan–Meier生存曲线如图所示(n个= 10). *P（P）< 0.05, ****P（P）Mantel–Cox（log-rank）测试<0.0001。
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