Targeted mass spectrometry-based assays enable multiplex quantification of receptor tyrosine kinase, MAP Kinase, and AKT signaling

doi:10.1016/j.crmeth.2021.100015

.2021年7月26日；1(3):100015.

doi:10.1016/j.crmeth.2021.100015。 Epub 2021年6月14日。

基于靶向质谱的分析能够对受体酪氨酸激酶、MAP激酶和AKT信号进行多重量化

附属公司

¹美国华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心临床研究部，邮编98109。
²NCI RAS倡议，癌症研究技术计划，美国马里兰州弗雷德里克弗雷德里克国家癌症研究实验室，邮编：21701。
^三美国佛罗里达州坦帕市莫菲特癌症中心和研究所分子肿瘤学系和肿瘤生物学系蛋白质组学和代谢组学核心。
⁴美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院和哈佛大学博德学院，邮编02142。
⁵美国北卡罗来纳大学凯南-弗拉格勒商学院吉林斯全球公共卫生学院，北卡罗莱纳州教堂山，邮编27599。
⁶抗体表征实验室，Leidos Biochemical Research Inc，弗雷德里克癌症研究国家实验室ATRF，弗雷德里克，MD 21701，美国。
⁷美国国家癌症研究所癌症临床蛋白质组研究办公室，马里兰州贝塞斯达，20892。
⁸美国加州大学旧金山分校海伦·迪勒家庭综合癌症中心，邮编：94158。
⁹美国加州94063红木市Revolution Medicines公司生物系。

PMID： 34671754
预防性维修识别码： PMC8525888号
内政部： 2016年10月10日/j.crmeth.2021.100015

基于靶向质谱的分析能够对受体酪氨酸激酶、MAP激酶和AKT信号进行多重量化

杰弗里·怀特克等。单元格代表方法. 2021.

.2021年7月26日；1(3):100015.

doi:10.1016/j.crmeth.2021.100015。 Epub 2021年6月14日。

附属公司

¹美国华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心临床研究部，邮编98109。
²NCI RAS倡议，癌症研究技术计划，美国马里兰州弗雷德里克弗雷德里克国家癌症研究实验室，邮编：21701。
^三美国佛罗里达州坦帕市莫菲特癌症中心和研究所分子肿瘤学系和肿瘤生物学系蛋白质组学和代谢组学核心。
⁴美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院和哈佛大学博德学院，邮编02142。
⁵美国北卡罗来纳大学凯南-弗拉格勒商学院吉林斯全球公共卫生学院，北卡罗莱纳州教堂山，邮编27599。
⁶抗体特征实验室，Leidos生化研究公司，Frederick癌症研究国家实验室ATRF，Frederik，MD 21701，美国。
⁷美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症临床蛋白质组学研究办公室，20892。
⁸美国加州大学旧金山分校海伦·迪勒家庭综合癌症中心，邮编：94158。
⁹美国加州94063红木市Revolution Medicines公司生物系。

PMID： 34671754
预防性维修识别码： PMC8525888号
内政部： 2016年10月10日/j.crmeth.2021.100015

摘要

总结：Frederick National Laboratory for Cancer Research的美国国家癌症研究所Ras倡议的主要目标是开发量化Ras信号的方法，以促进新型癌症治疗药物的开发。我们使用靶向蛋白质组学技术开发了一个社区资源，包括256个经验证的基于多重反应监测（MRM）的多重分析，用于通过受体酪氨酸激酶、MAPK和AKT信号网络量化蛋白质表达和磷酸化。作为概念验证，我们量化了黑色素瘤（A375和SK-MEL-2）和结直肠癌（HCT-116和HT-29）细胞系对PLX-4720抑制BRAF的反应。这些分析用具有高分子特异性和定量精度的基于定量质谱的分析取代了60多个Western blot，显示了这些方法在药效学测量和作用机制研究中的价值。方法、适合用途的验证和结果作为社区资源在assesss.cancer.gov上公开提供。

动机：缺乏定量的、可复用的磷酸信号检测，限制了对癌症中异常信号的全面研究和新治疗方法的评估。为了缓解这一限制，我们试图开发使用靶向质谱的测定方法，通过受体酪氨酸激酶、MAPK和AKT信号网络来量化蛋白质表达和磷酸化。结果分析为替换60多个Western blot以高分子特异性和定量精确性检测癌症信号和肿瘤生物学提供了资源。

关键词：AKT；肿瘤信号；MAP激酶；RAS；RTK；分析资源；免疫-MRM；药效学；定量蛋白质组学；靶向治疗。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明作者声明没有竞争利益。

数字

图1
靶向癌症信号以促进细胞生长和增殖的定量分析面板的开发（A）RTK、MAPK和AKT信号网络被靶向用于基于MS的分析开发，以量化驱动癌症中细胞生长和增殖的蛋白质的表达和磷酸化。MRM分析小组靶向的蛋白质为蓝色；分析面板中未包含的其他信号节点以灰色显示；BRAF抑制剂PLX4720以红色显示。（B）不同的样品处理流程最终会使用每个分析物的加标稳定同位素标记标准（SIS）对胰蛋白酶肽进行LC-MRM。直接-MRM以高丰度蛋白质为靶点，IMAC-MRM以磷酸肽（即pSTY）为靶点在MRM之前进行富集，免疫-MRM使用定制单克隆抗体对选定的未修饰和磷酸化肽进行肽免疫亲和富集。维恩图显示了两种方法共同测量的肽。本文介绍了方案、试剂和分析表征数据，以及药效学和机理验证研究方法的实用性证明。

图2
主要通过细胞类型的生物差异对定量MRM数据组进行无监督聚类（A–B）直接-MRM（A）测量的蛋白质表达、IMAC-MRM（B）测量的磷酸化以及免疫-MRM（C）测量的蛋白表达和磷酸化进行无监督的聚类显示蛋白质表达和磷酸化主要逐细胞系聚集，次级聚集按对PLX处理的反应分组。行热映射值为Z轴使用对数计算每种肽分析物的中位数反应得分₂MRM数据的转换峰面积比（轻/重）值（n=2个生物重复）；缺失值用LLOQ值进行插补。

图3
MRM分析显示PLX4720治疗后黑色素瘤和结直肠癌细胞系中信号的定量变化蛋白质和磷酸化位点的选择性定量MRM测量热图，以检查MAPK的中心节点（RAS-RAF-MEK-ERK）在四种癌细胞系中传递和证明先前发表的BRAFi耐药机制。显示的MRM结果来自免疫-MRM分析，但p-EGFR除外^1092日元和p-CTNB1^552英镑（这些是IMAC-MRM结果）。对于MRM分析，p-AKT1^第473页选择AKT2肽LLPP与pan AKT1/2/3蛋白印迹（WB）进行相关性研究。热图中的每个细胞根据所有样品中单个分析物的标准化值进行着色。定量值与WB（STAR方法）分析相关。分析物命名基于MRM分析的肽序列（左侧，“MRM分析”标签）和报告的WB抗体特异性（右侧，“Western blot”标签）。使用文丘林作为WB的负荷控制。条形图是重复生物复制的平均值。误差条显示重复生物复制的范围。

图4
PLX4720治疗后结直肠癌和黑色素瘤细胞株中反常ERK1/2激活的定量说明了通过免疫-MRM测量可获得的分子细节（A）ERK1/2肽的相对定量绘制为平均峰面积比（PAR）比较细胞系±PLX4720中的轻内源性和重内标物。误差条显示重复生物复制的范围。虚线表示近似定量下限（LLOQ）。（B）来自相同细胞裂解物中ERK1/2表达和磷酸化的蛋白质印迹（WB）的密度测定值用于与免疫MRM分析的相关性。（C）总蛋白表达的相对水平（绘制为肽ALDLLDR的PAR）与磷酸化p-ERK1的水平相关^泰尔204括号中显示了蛋白质中肽的氨基酸残基数。样品根据电池线和面板顶部键中的±PLX4720进行彩色编码；数据标有时间点。

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