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。2021年9月27日；31（18）：3973-3983.e4。
doi:10.1016/j.cub.2021.06.063。 Epub 2021年7月22日。

神经干细胞中的不对称核分裂产生大小、包膜成分和染色质组织不同的同胞核

香塔尔·鲁比内 1, 伊恩·怀特 2, 巴兹·鲍姆 三
附属公司

神经干细胞中的不对称核分裂产生大小、包膜成分和染色质组织不同的同胞核

香塔尔·鲁比内等。 当前生物。 。

摘要

尽管核是真核生物的定义特征，但我们仍然不完全理解核室在分裂过程中是如何复制和分割的。对于在进入有丝分裂期时没有完全分解核膜的生物体来说，情况尤其如此。在研究进行不对称分裂的果蝇神经干细胞的这一过程中，我们发现核室边界在有丝分裂期间持续存在，这要归功于支持核膜的维持。然后，这个有丝分裂的核膜被不对称地重塑和分割，形成两个子核，它们的核膜组成不同，体积差异大于30倍。发现核大小的显著差异取决于两个连续的过程：在由中心纺锤体定义的有丝分裂出口处的不对称核膜重新密封，以及似乎取决于ER/核膜的可用局部储库的差异核生长，它在两个子单元之间不对称分割。重要的是，子核的大小和组成上的这些不对称，以及染色质组织上的相关不对称，在皮质释放和细胞命运决定因素的核导入之前很久就变得明显了。因此，干细胞分裂期间的非对称核重构可能通过在兄弟核中启动不同的转录程序来促进细胞多样性的产生，从而导致子细胞身份和命运的后期变化。

关键词：不对称分工；细胞命运；染色质；闭合有丝分裂；胞质分裂；核分裂；核膜重塑；开放性有丝分裂；主轴；干细胞。

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利益声明作者声明没有相互竞争的利益。

数字

无
图形摘要
图1
图1
在有丝分裂期间，苍蝇成神经细胞的核膜保持不变，并重塑以生成大小和核膜组成不同的两个同胞核（A–D）表达樱桃：：Jupiter的有丝分裂成神经细胞与（A）CD8:：GFP，（B）Klaroid:：GFP、Klarsicht:：GFP:或BIP-SfGFP:：HDEL，（C）NLS:：5GFP或Rps13：GFP或（D）结合编号107:：GFP或编号58:：GFP。黄色箭头表示核孔蛋白密度较高。（E和F）在不同细胞周期阶段进行的电子显微镜检查：（E）放大区域在（F）中标记为黄色；黄色箭头显示核孔；白色箭头表示核膜上有洞；N、 核隔间；C、 细胞质。比例尺为5μm。另请参见图S1和视频S1、S2、S3和S4。
图2
图2
在有丝分裂（A）过程中，有丝分裂神经母细胞表达LamDm0：：GFP和Cherry：：Jupiter，核膜需要维持核膜。黄色箭头表示LamDm0密度较高。（B） LamDm0:：GFP在整个细胞周期中沿核膜和细胞质的平均强度。（C） 在25个细胞的5个不同阶段测量了核膜和细胞质之间的LamDm0平均强度比。灰色区域对应于1±0.25的比率。条形图表示平均值±标准偏差。星号表示统计显著性，来源于未配对t检验：∗p≤0.05，∗∗∗p≤0.001，以及∗∗∗∗p≤0.0001。（D） LamDm0、dMoesin和DAPI的免疫染色。（E） 丝氨酸25和DAPI上非磷酸化LamDm0的免疫染色。（F） 表达Klaroid:：GFP、Cherry:：Jupiter的神经母细胞的代表性时间间隔，以及针对LamDm0的RNAi。黄色恒星表明存在完整的前期核室。（G和H）CLEM显示，在LamDm0 RNAi表达后，核膜逐渐分散到细胞质中（G），核室完整性（H）丧失。（一） 定量表达针对LamDm0的RNAi并显示正常或异常核分裂的有丝分裂成神经细胞。分析的细胞数=123。（J） 表达Klaroid:：GFP和Cherry:：Jupiter的LamDm0 RNAi成神经细胞的典型延时图像，其中核膜分散，细胞核在有丝分裂出口处无法重组。至少进行了3项独立实验。比例尺为5μm。另请参见图S2和视频S5。
图3
图3
核分裂是一个依赖密封的过程（a）分裂表达Cherry：：Jupiter和CD8：：GFP的成神经细胞。红色虚线表示皮层犁沟的位置。（B） 显示细胞和细胞核从顶部到基底皮层7个时间点的宽度的图表。（C） 显示有丝分裂期间十个细胞沿顶基轴的细胞和细胞核长度的图表。误差条表示标准偏差，虚线表示后期开始。（D） 显示有丝分裂期间分裂沟区域的细胞和细胞核宽度的图表，从10个细胞中平均得出。误差条表示标准偏差，虚线表示后期开始，蓝色和绿色箭头分别表示皮层和核沟的开始。（E） 表达CD8:：GFP和Cherry:：Jupiter的有丝分裂成神经细胞的代表性延时序列，以及LatrunculinA、CytochalasinD或伴刀豆球蛋白A治疗后细胞分裂素失败。（F） 表达CD8:：GFP和Cherry:：Jupiter的Latrunculin处理的神经母细胞的时间推移图像。黄色正方形表示在描记图上使用的区域，黄色箭头表示核密封的位置。（G） 分裂神经母细胞的量化，细胞分裂失败但不进行核分裂的神经母细胞，或表达针对AuroraB、Pavarotti或Tumbleweed的RNAi后细胞和核分裂均失败的神经母公司。显示了针对每个条件分析的单元数。（H） 神经母细胞表达RNAi对抗AuroraB、CD8：：GFP和Cherry：：Jupiter的典型延时图像，细胞和核分裂均失败。橙色箭头表示没有中心心轴。（I和J）表达RNAi的成神经细胞对风滚草、CD8:：GFP和樱桃：：Jupiter、细胞分裂失败（I）或细胞和核分裂均失败（J）的代表性延时图像。橙色箭头表示存在（I）或不存在（J）中心主轴。对于每个实验，n≥3。比例尺为5μm。另请参见图S3和视频S6。
图4
图4
不对称的核分裂取决于纺锤体（A）分裂成神经细胞表达Klaroid:：GFP和Cherry:：Jupiter所指示的位置的核密封。橙色和黄色箭头表示信封密封事件。（B） 表达CD8：：GFP和Cherry：：Jupiter的成神经细胞的艾利斯康图片。黄色箭头表示密封部位。Kymograph沿着顶基轴进行。（C） 显示主轴不对称比和核直径比的图表（n=33）。星号表示统计显著性，来源于未配对t检验：无显著性。（D） 显示纺锤体和核不对称之间相关性的曲线图（n=68）。（E） 表达CD8：：GFP、Cherry：：Jupiter和Galphai的神经母细胞的代表性延时图像。定量显示细胞、细胞核和纺锤体在密封时的不对称比率。（F） 显示纺锤体和核不对称（左侧）或细胞和核不对称之间（右侧）相关性的曲线图；（n=8）。（G） 核封闭时的成神经细胞图像，显示中央纺锤体和核大小的不对称性（绿色虚线）。（H） 表达Cherry：：Jupiter、Patronin：：GFP和GBP-PonLD的神经母细胞的典型延时图像。绿色虚线对应于原子核。（一） 图中显示了对照神经母细胞的纺锤体不对称性（左）和核不对称性（右），以及在表达Patronin:：GFP和GBP-PonLD后（n=25和n=24）。条形图表示平均值±标准偏差。星号表示统计显著性，来源于未配对t检验：∗∗∗∗p≤0.0001。对于每个实验，n≥3个实验。比例尺为5μm。另请参见图S4。
图5
图5
最终的核大小是通过两个子核的差异生长获得的（A）散点图，显示了核封闭后或G1期间成神经细胞和GMC的核直径。条形图表示平均值±标准偏差。星号表示统计显著性，来源于未配对t检验：∗∗∗∗p≤0.0001。（B） 显示神经母细胞和GMC细胞核直径的图表，从细胞核封闭到G1。（C） 表达Klaroid:：GFP和Cherry:：Jupiter的神经母细胞；黄色箭头表示核膜的细胞质贮存器。（D） Airyscan拍摄的表达ER标记物Bip-SfGFP:：HDEL和Cherry:：Jupiter的神经母细胞典型延时图像。黄色箭头表示核膜的细胞质贮存器。（E） 图中显示了使用两个不同探针密封时的不对称内质网分离。在整个成神经细胞和GMC体积中测量总强度，并绘制Nb/GMC的比率。条形图表示平均值±标准偏差。星号表示统计显著性，来源于未配对t检验：无显著性。（F） 电子显微照片。ER/核膜以粉红色突出显示。（G） 培养在表达CD8:：GFP和Cherry:：Jupiter的伴刀豆球蛋白a上的神经母细胞的典型延时图像。（H） 与（G）中所示成神经细胞相对应的图形，显示了整个细胞周期中两个细胞核的大小。（一） 表达CD8:：GFP的Latrunculin处理神经母细胞的典型延时图像。黄色箭头表示有可用的核膜。（J） 典型的Latrunculin处理的神经母细胞的图表显示了整个细胞周期中两个细胞核的大小。（K） 代表性图片显示野生型和双核成神经细胞表达CD8:：GFP和樱桃：：Jupiter，包含两个大小不同或相似的细胞核。（五十） 散点图显示了野生型、DMSO-、Latrunculin-、Cytochalasin-或伴刀豆球蛋白处理的成神经细胞兄弟核之间的核面积比率。图中的灰色区域表示核面积比等于1±0.25。分析的细胞数=148。星号表示统计显著性，来源于未配对t检验：无显著性，∗∗∗∗p≤0.0001。对于每个实验，n≥3。比例尺为5μm。另请参见图S5和视频S7。
图6
图6
不对称核分裂影响染色质组织（A）表达DNA标记His2A:：RFP和皮质标记Sqh:：GFP的成神经细胞的典型延时图像。（B） 图表显示了GMC和成神经细胞核的His2A:：RFP随时间的平均强度，n=5。误差线表示标准偏差。（C） 野生型成神经细胞固定并染色以检测DAPI、H3K4me2、Tubulin和Phalloidin。黄色箭头表示两组姐妹染色单体上的H3K4me2强度相似。（D） 野生型成神经细胞固定并染色以检测DAPI、H3K4me2和Prospero。白色虚线显示了核生长期间和之后的核区域。（E） 对于早期晚期到晚期的细胞，图（左）显示了x轴上的核大小比率与y轴上DAPI在整个核体积上的总强度比率（成神经细胞/GMC），以及（右）y轴上H3K4me2的当量。（F） 双核成神经细胞染色检测DAPI和H3K4me2。该图显示了显示两个不同大小（n=10）的双核成神经细胞的核面积比（左）和DAPI或H3K4me2总和强度比（右）。条形图表示平均值±标准偏差。星号表示统计显著性，来源于未配对t检验：∗∗p≤0.01。对于每个实验，n≥3。比例尺为5μm。另请参见图S6。
图7
图7
不对称核分裂产生两个子核，在细胞命运决定因素的核输入之前，这两个子核在大小、包膜组成和染色质组织上不同（A）图显示了与核分裂、胞质分裂和Prospero的核输入相关的连续步骤的时间。（B） 图示不对称核分裂和细胞命运决定因子释放过程的不同步骤。NPC在后期发作前330秒解体。在后期发病200秒后，核包膜以纺锤依赖的方式不对称密封，以产生两个大小有中等差异的子核。这种不对称性在末期因核的差异生长而增加，直到后期发作480秒后核大小稳定。这与染色质的差异堆积以及新成神经细胞和GMC细胞核之间组蛋白标记的不对称分布有关，在细胞核导入细胞命运决定因子之前（后期发病后980秒）。
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