A Novel Netrin-1-Derived Peptide Enhances Protection against Neuronal Death and Mitigates of Intracerebral Hemorrhage in Mice

doi:10.3390/ijms22094829

.2021年5月2日；22(9):4829.

doi:10.3390/ijms22094829。

一种新的内酯-1-衍生肽增强小鼠神经死亡保护和减轻脑出血

林刘（Lin Liu）¹, 刘开杰¹, 曹建波¹, 泾阳¹, 华丽余¹, 小晓河¹, 子轩河¹, 朱晓娟¹

附属公司

PMID： 34063230
预防性维修识别码：第8125294页
内政部： 10.3390/ijms22094829

一种新的内酯-1-衍生肽增强小鼠神经死亡保护和减轻脑出血

林刘（Lin Liu）等。国际分子科学杂志. 2021.

.2021年5月2日；22(9):4829.

doi:10.3390/ijms22094829。

作者

林刘（Lin Liu）¹, 刘开杰¹, 曹建波¹, 泾阳¹, 华丽余¹, 小晓河¹, 子轩河¹, 朱晓娟¹

附属

¹东北师范大学遗传学与细胞学研究所，长春130021。

PMID： 34063230
预防性维修识别码： PMC8125294号
内政部： 10.3390/ijms22094829

摘要

据报道，Netrin-1参与中枢神经系统损伤后的神经保护。然而，Netrin-1的最小功能域仍不明确，它可以保护神经保护，但避免Netrin的主要副作用。在这里，我们研究了源自Netrin-1的EGF3结构域（残基407-422）的肽E1的神经保护作用。我们发现它与缺失的结直肠癌（DCC）相互作用，激活局灶黏附激酶磷酸化，表现出神经保护作用。在实验性脑出血（ICH）小鼠模型中，给予肽E1能够通过减少细胞凋亡来改善功能恢复。总之，我们揭示了参与ICH后恢复过程的Netrin-1的功能序列，并确定了治疗ICH的候选肽。

关键词：内特林-1；氯化血红素；脑出血；神经保护；肽。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。资助者在研究设计中没有任何作用；收集、分析或解释数据；在撰写手稿时，或在决定公布结果时。

数字

图1
Netrin-1的EGF3域是Netrin-1/DCC相互作用的关键区域。(A类)Netrin-1结构图。Netrin-1结构包括Netrin-1全长、Netrin-1-（∆407-443）和GST-EGF3。(B类)通过与BSA标准曲线的比较，对纯化的Netrin-1-（∆407-443）-Myc/His进行量化。(C类)GST-DCC FN5结构域融合蛋白和GST单独对下拉部分进行免疫印迹。(D类)分别用对照培养基Netrin-1-myc/his和Netrin-1-（∆407-443）-myc/his培养30分钟后，表达Flag-DCC的293T细胞的免疫荧光图像，以及定量分析。比例尺，10µm。(E类)GST-EGF3融合蛋白和GST对下拉部分进行免疫印迹。(F类)分别用对照培养基和FITC标记的Pep EGF3孵育30分钟后，表达Flag-DCC的293T细胞的免疫荧光图像和定量分析。比例尺，10µm。

图2
EGF3域激活Netrin-1的下游通路。(A类)实验程序。(B类)用Netrin-1、Netrin-1-（∆407-443）或对照培养基刺激皮层神经元（E17和DIV3）20分钟。用抗p-FAK-861抗体孵育细胞裂解液以确认Netrin-1的活性。(C类)western blot结果的定量分析(B类).n个= 3. (D类)用1.5μM GST（+）、1.5μM GST-EGF3融合蛋白（+）或1.5μM Netrin-1（+）培养基处理皮层神经元（DIV3）20分钟。细胞裂解物与抗p-FAK-861、抗p-SFK-418和抗p-ERK-202/204孵育。(E类–**G公司**)western blot结果的定量分析(D类).n个= 3. 数据以平均值±SEM表示。本图所示的所有统计分析均使用单向方差分析(*第页< 0.05, **第页< 0.01; ns，不显著）。数据分析详情见补充表S1。

图3
EGF3结构域的最小序列激活Netrin-1的下游通路。(A类)肽的图解。(B类)用梯度浓度的肽E1刺激皮层神经元（DIV3）。细胞裂解物与抗p-FAK-861、抗p-SFK-418和抗p-ERK-202/204孵育。(C类)用梯度浓度的肽E2处理培养的皮层神经元。收集裂解液并与指示的抗体孵育，以测量FAK、SFK和ERK的磷酸化(D类–F类)肽E1在神经元中诱导的FAK、SFK和ERK磷酸化程度的量化如图所示(B类).n个= 3. (**G公司**–我)肽E2诱导的FAK、SFK和ERK磷酸化程度的量化如所示(C类).n个= 3. (J)来源于DCC野生型和纯合突变胚胎的皮层神经元用Netrin-1或Netrin-1来源的肽刺激并裂解。将所得裂解产物进行免疫印迹。(**K（K）**)DCC突变神经元中FAK PY861和DCC水平的量化如图所示(J).n个= 3. 数据以平均值±SEM表示。本图所示的所有统计分析均使用单向方差分析(*第页< 0.05; ns，不显著）。数据分析详情见补充表S1。

图4
肽E1在体外改善氯化血红素诱导的细胞死亡。(A类)暴露于Hemin（60µM）的培养NLT细胞中Netrin-1和DCC的Western blot。(B类)western blot结果的定量分析(A类).n个=3。(C类)CCK-8分析表明，系列肽没有改变细胞活性。n个= 4. (D类)1.5µM Pep E1在暴露于氯化血红素（60µM）后加入，可保持NLT细胞的活力。n个= 4. (E类)暴露于氯化血红素（60µM，6 h）的NLT细胞的活（绿）/死（红）检测。比例尺，50μm。(F类,**G公司**)活/死试验的定量分析(E类).n个= 9. (**H（H）**)CCK-8检测表明，Pep E1可以减少氯化血红素诱导的原代培养神经元细胞死亡。n个= 8. (我)原代培养神经元的活/死分析成像（50µM，6 h）。比例尺，50μm。数据以平均值±SEM表示。本图所示的所有统计分析均使用单向方差分析或双向方差分析(*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001; ns，不显著）。数据分析详情见补充表S1。

图5
Netrin-1衍生肽E1促进ICH后的恢复过程。(A类)在小鼠ICH模型中腹腔注射肽TE1的实验范式示意图。(B类)记录各组ICH后的存活率，采用Kaplan-Meier方法。n个= 10. (C类)ICH后5天体重发生变化。n个= 6. (D类)在C57小鼠纹状体注射等比例墨水（总计0.6µL）的拼贴/盐水混合物，ICH后5天，显示墨水面积的代表性图像在使用/不使用肽TE1的小鼠中相似。(E类,F类)IP注射肽TE1（12 mg/kg），但不注射TAT（12 mg/kg/kg）对照，通过胶带去除任务监测行为改善(E类)或角落任务(F类). 盐分，n个=10只个体动物；脑出血，n个=6只个体动物；ICH+TAT，n个=6只个体动物；ICH+TE1，n个=8只个体动物。(**G公司**)ICH后5天，用/不用肽TE1处理小鼠的代表性苏木精和伊红染色切片。比例尺，1 mm(**H（H）**)脑切片中出血量的定量显示(**G公司**). 盐分，n个=10只个体动物；脑出血，n个=6只个体动物；ICH+TAT，n个=6只个体动物；ICH+TE1，n个=8只个体动物。数据以平均值±SEM表示。本图所示的所有统计分析均使用单向方差分析或双向方差分析(*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001; ns，不显著）。数据分析详情见补充表S1。

图6
内脏素-1衍生肽E1对脑出血后神经元死亡和变性有保护作用，但对星形胶质细胞无保护作用。(A类)ICH后5天，用TE1处理/不用TE1处理的小鼠的代表性氟玉C染色切片。比例尺分别为50μm和10μm。(B类)血肿周围区荧光玉石C阳性细胞的定量(n个= 4). (C类)TUNEL染色显示脑出血后5天TE1对继发性脑损伤（SBI）的影响。来自Saline、ICH、ICH+TAT、ICH+TE1组的代表性图像。除盐水组外，其余各组均接受ICH治疗。比例尺分别为50μm和10μm。(D类)TUNEL阳性神经元百分比的定量分析(C类).n个= 4. (E类)ICH后5天用GFAP对TUNEL进行染色。来自Saline、ICH、ICH+TAT、ICH+TE1组的代表性图像。比例尺分别为50μm和10μm。(F类)TUNEL阳性星形胶质细胞百分比的定量分析(E类).n个= 4. 数据以平均值±SEM表示。本图所示的所有统计分析均使用单向方差分析(*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页< 0.0001; ns，不显著）。数据分析的细节见补充表S1。

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1. Schrag M.，Kirshner H.脑出血的管理：JACC焦点研讨会。美国大学J.Am.Coll。心脏病。2020;75:1819–1831. doi:10.1016/j.jacc.2019.10.066。-内政部-公共医学

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