Ionizing Radiation-Induced Extracellular Vesicle Release Promotes AKT-Associated Survival Response in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells

doi:10.3390/cells10010107

.2021年1月8日；10(1):107.

doi:10.3390/cells10010107。

电离辐射诱导的细胞外囊泡释放促进SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞AKT相关生存反应

弗拉维亚·托托利奇¹, 西蒙·旺巴卡¹, 伯纳黛特·因科恰蒂¹, 勒努·达亚尔², 卡蒂亚·阿奎拉诺¹, 安娜·乔瓦内蒂^三, 斯特凡诺·鲁菲尼¹

附属公司

¹意大利罗马托尔韦加塔大学生物系，邮编：00133。
²Sanorva Biotech Private Limited，印度迈苏鲁570008。
^三ENEA，能源和可持续经济部，意大利罗马00123。

PMID： 33430027
预防性维修识别码：项目管理委员会7827279
内政部： 10.3390/细胞1010107

电离辐射诱导的细胞外囊泡释放促进SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞AKT相关生存反应

弗拉维亚·托托利奇等。细胞. 2021.

.2021年1月8日；10(1):107.

doi:10.3390/cells10010107。

作者

弗拉维亚·托托利奇¹, 西蒙·旺巴卡¹, 伯纳黛特·因科西亚蒂¹, 勒努·达亚尔², 卡蒂亚·阿奎拉诺¹, 安娜·乔瓦内蒂^三, 斯特凡诺·鲁菲尼¹

附属公司

¹意大利罗马托尔韦加塔大学生物系，邮编：00133。
²Sanorva Biotech Private Limited，印度迈苏鲁570008。
^三ENEA，能源和可持续经济部，意大利罗马00123。

PMID： 33430027
预防性维修识别码：项目管理委员会7827279
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摘要

放射治疗是消除肿瘤最有效的方法之一；然而，在某些形式的神经母细胞瘤中，辐射会增加继发肿瘤的风险，因为受辐射细胞能够通过囊泡分泌向未受辐射细胞传递促生存信号。本研究的目的是描述X射线照射后人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y释放的囊泡及其增强非照射SH-SY5 Y细胞侵袭性的能力。我们首先纯化了SH-SY5Y细胞在X射线照射后释放的细胞外小泡，然后测定了它们的总量、尺寸、膜蛋白组成和细胞摄取。我们还研究了这些细胞外小泡对受体SH-SY5Y细胞的存活、迁移和DNA损伤的影响。我们发现，暴露在X射线下会增加细胞外小泡的释放，并改变其蛋白质组成。这些小泡很容易被未经辐照的细胞吸收，导致活性、迁移和抗辐射性增加。在MYCN公司-扩增的SK-N-BE细胞系。我们的研究表明，辐射后神经母细胞瘤细胞释放的小泡刺激增殖和侵袭性，这与未辐射细胞的上皮细胞向间充质细胞转化有关。此外，我们的结果表明，至少在神经母细胞瘤中，靶向细胞外囊泡可能是一种新的治疗方法，可以抵消放射治疗的副作用。

关键词：DNA损伤；DNA修复；EMT；电动汽车；X射线；旁观者效应；癌症；外泌体；抗辐射性；放射治疗。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
非辐射/辐射神经母细胞瘤细胞释放的细胞外囊泡（EVs）的特征。(A类)SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞释放EV大小分布的代表性直方图。尺寸范围由水平条中的不同颜色表示；(B类)非辐射和辐射神经母细胞瘤细胞释放EVs的代表性分布维曲线；(C类)流式细胞术定量分析SH-SY5Y EVs（EVs/5×10⁶细胞）；(D类)SH-SY5Y EVs的蛋白质定量；(E类)流式细胞术定量分析SK-N-BE EVs（EVs/5×10⁶细胞）；(F类)SK-N-BE EVs的蛋白质定量；(**G公司**)通过Western blot分析SH-SY5Y EVs，以测量CD63、FLOT1、CD9和CD81蛋白水平。Ponceau红染色和Bax分别作为负荷和阴性对照；(**H（H）**)与三个western blot相关的密度测定。数据表示为平均值±标准差（n=3，对< 0.01 ***,对<0.001 vs.EVs0或EVs0.1）。

图2
受体细胞对EV的摄取。(A类)SH-SY5Y与绿色SYTO孵育^®RNASelectTM标记EV，并通过荧光显微镜和共焦显微镜成像（左面板和右面板分别）；细胞质和细胞核分别用α-管蛋白和蓝色Hoechst 33342染色。右侧面板表示共焦显微镜分析的三维重建图像；(B类)SH-SY5Y与绿色SYTO孵育^®RNASelectTM标记EVs并用流式细胞术分析。代表性FL1-H与SSC-H点图，显示用于确定纳入标记EV的细胞的门控策略（红色方框）（上面板）。流式细胞术分析15分钟、1小时和2小时处理后SH-SY5Y细胞对标记EVs的摄取（底部面板）。数据表示为平均值±S.D.（n=4*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001, ****对<0.0001 vs.15分钟摄入；n=4，°对<0.05, °°对< 0.01, °°°对<0.001 vs.0 Gy）。

图3
EVs对受体细胞活性的影响。神经母细胞瘤细胞用EVs0或EVs10预处理1h，然后暴露/模拟暴露于X射线。(A类)用台盼蓝排斥法测定SH-SY5Y细胞的细胞计数。(B类)照射后24小时，采用MTT法检测SH-SY5Y细胞的活性。在490 nm处测量吸光度。(C类)流式细胞术检测SH-SY5Y细胞G2-M期百分比；(D类)SH-SY5Y细胞中p21的蛋白质水平，以及(E类)与三个western blot相关的密度测定。(F类)SH-SY5Y细胞中pPDK1、pAKT（T308）、AKT、pFOXO1（Ser256）的蛋白质水平，以及(**G公司**)与三个western blot相关的密度测定。(**H（H）**)通过台盼蓝排除试验测定SK-N-BE细胞的细胞计数。(我)照射后24小时用MTT法测定SK-N-BE细胞的存活率。在490nm处测量吸光度；(J型)流式细胞术测定SK-N-BE细胞在G2-M期的百分比。数据表示为平均值±S.D.（n=4*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001, ****对<0.0001 vs.CTR）。

图4
EVs诱导的SH-SY5Y迁移需要AKT激活。SH-SY5Y细胞用LY处理/模拟处理，然后暴露于EVs0或EVs10。(A类)以GAPDH为负荷对照，通过Western blotting测定pAKT（T308）和AKT的蛋白水平。(B类)使用Ibidi培养插入物进行伤口愈合分析。取下插入物后24和48小时记录细胞迁移（上面板）；伤口愈合率（底部面板）。(C类)通过RT-qPCR检测N-Cadherin和Vimentin的mRNA表达。数据表示为平均值±S.D.（n=3**对< 0.01, ***对< 0.001, ****对<0.0001，与CTR相比；n=3°对与EVs0相比<0.01）。

图5
EV保护细胞免受辐射诱导的DNA损伤。用EVs0、EVs0.1、EVs1和EVs10预处理神经母细胞瘤细胞1h，然后暴露/模拟暴露于X射线。2小时后处理SH-SY5Y细胞进行彗星试验(A类)和24小时(B类); (C类)以Tubulin为负荷对照，采用Western blotting法测定SH-SY5Y细胞中pATM（S1981）、ATM、BRCA1和p53蛋白水平。(D类)上述蛋白质的相对密度分析。(E类)以Tubulin为负荷对照，采用Western blotting法测定SK-N-BE细胞中pATM（S1981）、ATM、BRCA1和p53蛋白水平。(F类)上述蛋白质的相对密度分析。数据表示为平均值±S.D.（n=4*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001, ****对<0.0001 vs.6 CTR）。

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