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.2021年1月；22(1-2):23-37.
doi:10.1111/tra.12771。 Epub 2020年12月1日。

ALFY中一种高度保守的谷氨酸抑制膜结合以帮助清除聚集物

埃林·莱因哈特 1, 妮可·A·利特 2, 莎拉·卡泽内尔 1, 玛丽亚·佩莱格里尼 1, 山本爱 2, 迈克尔·J·拉古萨 1 三
附属公司

ALFY中一种高度保守的谷氨酸抑制膜结合以帮助清除聚集物

艾琳·F·莱因哈特等。 交通. 2021年1月.

摘要

自噬链接FYVE蛋白（ALFY）是一种大的多域蛋白，通过选择性自噬参与蛋白质聚集体的降解。ALFY的C末端FYVE结构域已被证明与磷脂酰肌醇3-磷酸（PI（3）P）结合；然而，ALFY仅与细胞中的其他FYVE域部分共定位。因此，我们询问ALFY的FYVE结构域与其他FYVE-结构域相比是否具有独特的膜结合特性，以及这些特性是否会影响其在体内的功能。我们发现ALFY的FYVE结构域在体外与含PI（3）P的膜弱结合。这种弱结合是由于ALFY的FYVE结构域的膜插入环中存在高度保守的谷氨酸，而这种谷氨酸在任何其他人类FYVE-结构域中都不存在。此外，这种谷氨酸不仅在体外减少与膜的结合并抑制其在体内靶向膜，而且对ALFY清除蛋白质聚集物的能力也很重要。

关键词：ALFY；FYVE域；自噬；核磁共振波谱；磷脂酰肌醇3-磷酸；蛋白质结构。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

数字

图1。
图1.ALFY-FYVE与含有PI（3）P的脂质体弱结合。
A） 用ALFY-FYVE或EEA1-FYVE和由PC、PS和指示的磷酸肌醇组成的脂质体以5%摩尔比进行脂质体沉淀测定。上清液（S）和颗粒（P）组分的代表性SDS-PAGE凝胶如图所示。B） 通过密度测定法定量颗粒部分中的蛋白质百分比。误差线表示三个独立实验的标准偏差。使用Sidak多重比较检验，通过普通双向方差分析确定统计显著性。*，p<0.0212；****，p<0.0001 C）用脂质体沉淀法检测ALFY-FYVE和EEA1-FYVE的特异性。D） 通过密度测定法定量颗粒部分中的蛋白质百分比。误差线表示三个独立实验的标准偏差。使用Tukey多重比较试验，通过普通双向方差分析确定统计显著性。*，p＜0.0132；***，p<0.0001。E） 用脂质体沉淀法检测ALFY-2xFYVE和EEA1-2xFYVE的特异性。F） 通过密度测定法定量颗粒部分中的蛋白质百分比。误差线表示三个独立实验的标准偏差。使用Tukey多重比较检验，通过普通双向方差分析确定统计显著性，p<0.0001。
图2。
图2 ALFY-FYVE的核磁共振结构。
A） ALFY-FYVE的带状图显示了束内20个结构在两个不同方向上的重叠。B） ALFY-FYVE的卡通表示以与A中相同的两个方向显示。N和C端子被标记，锌原子显示为灰色球体。C） 将ALFY-FYVE（青色）的卡通表示与EEA1-FYVE的卡通表示（洋红色，PDB代码1HYI）重叠，以与A.中相同的两个方向显示。L3497显示为棒状表示，以突出ALFY和EEA1之间此循环位置的差异。D） 协调PI（3）P头部组结合的两个残基显示为ALFY的青色（R3472和H3474）和EEA1的洋红（R1370和H1372）的棒状表示。
图3。
图3 ALFY-FYVE含有一种高度保守的谷氨酸，这种谷氨酸在人类FYVE-的其他结构域中没有发现。
A） 不同ALFY同源物FYVE结构域序列的比对显示E3471的红色保守性。带负电荷的残基为红色，带正电荷的残基为蓝色，极性残基为黄色，非极性残基为绿色。C） 将ALFY-FYVE的结构与绑定到PI（3）P（PDB ID 1HYI）头部组的EEA1-FYVE结构对齐。然后移除EEA1-FYVE，以可视化PI（3）P与ALFY-FYVE结合的预期位置。ALFY-FYVE的卡通表示以青色显示，带有E3471，PDB ID 1HYI中PI（3）P的头部组显示为棒状表示。
图4。
图4.E3471影响脂质体结合。
A） 用WT ALFY-FYVE和ALFY-FEVE E3471K、E3471T或E3471V突变体进行脂质体沉降分析。脂质体由PC、PS和指示的磷酸肌醇以5%的摩尔比组成。上清液（S）和颗粒（P）组分的代表性SDS-PAGE凝胶如图所示。B） 通过密度测定法定量颗粒部分中的蛋白质百分比。误差线表示四个实验的标准偏差。使用Tukey多重比较检验，通过普通双向方差分析确定统计显著性，p<0.0001。C） 用WT EEA1-FYVE和EEA1-FY-VE V1369E突变株进行脂质体沉降分析。D） 通过密度测定法定量颗粒部分中的蛋白质百分比。误差线表示三个实验的标准偏差。使用Tukey多重比较检验，通过普通双向方差分析确定统计显著性。***，p=0.0006。E） 用ALFY-FYVE和ALFY-F-YVE E3471K突变体进行脂质体沉降分析，其中PS的百分比从0%到20%不等。E） 通过密度测定法定量颗粒部分中的蛋白质百分比。误差线表示三个实验的标准偏差。使用Tukey多重比较检验，通过普通双向方差分析确定统计显著性，p<0.0001。
图5。
图5..E3471没有减少ALFY-FYVE与Ins（1,3）P的结合2.
A） 250μM Ins（1,3）P存在下ALFY-FYVE的CSP数据2。A3448、R3473、H3474的峰值分配无法从初始ALFY-FYVE分配中转移，并且没有给定CSP值。B）1H（H）-15Ins（1,3）P浓度增加时50μM ALFY-FYVE的N HSQC光谱2头部组。这个1H（H）-15不含Ins（1,3）P的ALFY-FYVE的N HSQC光谱2头部组显示为蓝色。插图显示了G3457的化学位移扰动，箭头指向位移方向，随着Ins（1,3）P的增加2头部组浓度。C） ALFY-FYVE H3450（红色）、K3453（橙色）、E3455（绿色）、R3473（蓝色）和H3475（紫色）的CSP数据作为Ins（1,3）P的函数2头部组浓度。所有数据点均显示为圆圈。数据拟合显示为与数据点颜色相同的线。D）1H（H）-15Ins（1,3）P浓度增加时50μM ALFY-FYVE E3471K的N HSQC光谱2头组如B.E所示。ALFY-FYVE E3471K H3450（红色）、K3453（橙色）、E3455（绿色）、R3473（蓝色）和H3475（紫色）的CSP数据是Ins（1,3）P的函数2浓度。所有数据点均显示为圆圈。数据拟合显示为与数据点颜色相同的线。
图6。
图6..E3471调整了定位和骨料间隙。
A） 表达于酿酒酵母.宽场标尺为10μm，窄场标尺5μm。B） mCherry-ALFY-2xFYVE或mCherry-ALFY-2xFYVE E3471K和GFP-细胞器标记之间的染色酿酒酵母GFP-Sec7被用作晚期高尔基体/早期内体的标记，GFP-Vps4被用作晚期内体的标志，GFP-Vph1被用作空泡的标志，而GFP-Atg8被用作自噬体的标志。C） 用Ctrl（tdTomato）、tdTomato-ALFYC或tdTomato-ALFYC E3471K瞬时转染Exon1Htt103Q-HT细胞。转染后立即用Dox处理一部分Ctrl转染细胞。96小时后收集细胞裂解物，然后进行过滤捕集分析（FTA），以监测不溶性Exon1Htt103Q-HT的量。按照三角形所示，将样品从高到低分为四倍稀释液。D） FTA相对于控制的量化。Mann-Whitney U非参数检验显示Ctrl和ALFYC之间存在显著差异（U=0；p=0.006）；然而，在Ctrl和ALFYC E3471K之间没有检测到差异（U=5；p=0.070）。*表示ALFYC和ALFYCE3471K之间观察到的显著差异（U=4；p=0.047）。+dox、Ctrl、ALFYC和ALFYCE3471K的n值分别为3、5、5和5。E） 对B细胞进行Western blotting，以监测可溶性halo标记的Exon1Htt103Q-HT蛋白的数量。在这些实验中，文丘林被用作负荷控制。
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