USP7 targeting modulates anti-tumor immune response by reprogramming Tumor-associated Macrophages in Lung Cancer

doi:10.7150/thno.47137

.2020年7月23日；10(20):9332-9347.

doi:10.7150/thno.47137。 eCollection 2020。

USP7靶向性通过对肺癌中肿瘤相关巨噬细胞的重新编程调节抗肿瘤免疫反应

戴晓萌¹, 李森路¹, 苏克登¹, 《惊书梦》¹, 赵湾¹, Jing Huang（黄晶）¹, 孙亚杰¹, 颜虎¹, 卞武¹, 吴刚¹, 乔纳森·洛弗尔², 金洪林¹, 杨坤瑜¹

附属公司

¹华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022。
²纽约州立大学布法罗分校生物医学工程系，美国纽约州布法罗14260。

PMID： 32802195
预防性维修识别码：项目管理委员会7415808
内政部： 10.7150/thno.47137

USP7靶向性通过对肺癌中肿瘤相关巨噬细胞的重新编程调节抗肿瘤免疫反应

戴晓萌等。治疗诊断科技. 2020.

.2020年7月23日；10(20):9332-9347.

doi:10.7150/thno.47137。 eCollection 2020。

作者

戴晓萌¹, 李森路¹, 苏克登¹, 《惊书梦》¹, 赵湾¹, Jing Huang（黄晶）¹, 孙亚杰¹, 颜虎¹, 卞武¹, 吴刚¹, 乔纳森·洛弗尔², 金洪林¹, 杨坤瑜¹

附属公司

¹华中科技大学同济医学院协和医院肿瘤中心，武汉430022，中国。
²纽约州立大学布法罗分校生物医学工程系，美国纽约州布法罗14260。

PMID： 32802195
预防性维修识别码：项目管理委员会7415808
内政部： 10.7150/thno.47137

摘要

背景：肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）具有很强的可塑性，如果重新编程，可以清除肿瘤细胞并调节癌症免疫治疗的适应性免疫系统。去泛素酶（DUBs）可以从Ub修饰底物中去除泛素（Ub），它与致癌代谢有关，但不以调节TAM复极而著称。方法：采用逆转录-PCR检测巨噬细胞（MΦs）中DUB相关基因的表达。流式细胞术和免疫荧光检测肿瘤微环境和脾脏中免疫细胞的变化，包括M1（CD11b⁺功能4/80⁺CD86型⁺CD206型^-)和M2（CD11b⁺功能4/80⁺CD86型^-CD206型⁺)MΦs和IFN-γ⁺CD8（CD8）⁺T细胞。增殖试验用于测定经USP7抑制剂处理的M2MΦs对T细胞增殖的影响。Western blotting检测USP7的表达和MAPK通路的激活。TGCA数据库用于评估USP7在人肺腺癌（LUAD）免疫微环境中的作用。结果：筛选了51个DUB基因，确定USP7是M2中的一个高表达基因，而不是M1 MΦs。使用siRNA或USP7抑制剂特异性沉默USP7导致M2 MΦs的表型和功能改变，有利于CD8⁺T细胞增殖在体外.USP7抑制剂延缓Lewis肺癌小鼠的肿瘤生长，并促进M1 MΦs和IFN-γ的肿瘤浸润⁺CD8（CD8）⁺T细胞。TAM的消耗减弱了这些治疗效果。USP7抑制通过激活p38 MAPK通路介导MΦs重编程。服用USP7抑制剂可增加肿瘤中程序性细胞死亡配体1（PD-L1）的表达，而阻断程序性细胞死蛋白1（PD-1）可提供有效的抗肿瘤反应。临床数据库表明，USP7在LUAD中的高表达与先天性和适应性免疫负相关。结论：综上所述，这些结果提供了证据，表明针对USP7的治疗方法，结合免疫治疗，应该考虑用于肺癌治疗。

关键词：脱泛素酶；USP7；抗PD-1；巨噬细胞重编程；肿瘤相关巨噬细胞。

©作者。

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利益冲突声明

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

**方案1**
靶向抑制USP7通过对肺癌中肿瘤相关巨噬细胞的重新编程调节抗肿瘤免疫反应。

图1
靶向USP7抑制小鼠M2表型和功能*在体外*.（A）通过RT-PCR检测ANA-1诱导的M0、M1（LPS/IFN-γM1）和M2（IL-4/13 M2和IL-10 M2）中与DUBs相关的常见基因的mRNA表达。(B类)通过RT-PCR检测骨髓基质干细胞诱导的MΦs、M1和M2中USP7的mRNA表达。(C类)Western blotting显示USP7在骨髓基质干细胞诱导的MΦ、M1和M2中的表达。(**D-E公司**)流式细胞术分析经P5091（5μM或10μM）处理24 h后，IL-4/13诱导的BMDM M2细胞中CD206的表达。数据表示为平均值±SEM（n=3）。(F类)通过western blotting检测用NC或USP7-siRNA转染的BMDM中USP7的表达。(**G公司**)流式细胞术检测NC siRNA组和USP7 siRNA组BMDM中CD206的表达。(**H-I公司**)流式细胞术分析CD8表面CFSE的表达⁺T细胞在DMSO-或P5091-（5μM或10μM）条件培养基的存在下处理IL-4/13诱导的BMDM M2细胞。数据表示为平均值±SEM（n=3）。

图2
**靶向USP7抑制肿瘤生长并诱导局部抗肿瘤免疫体内.**(A类)在P5091和对照组中采集并拍摄肿瘤。(B类)P5091或Vehicle治疗后Lewis肿瘤生长*体内试验。*数据表示为平均值±SEM（每组6个）。(C类)P5091组和对照组每只小鼠肿瘤体积增长的蜘蛛图。(天)流式细胞术检测TAM的门控策略。(**E-G公司**)M1的比例(电子)和M2(F类)和M1/M2比率(**G公司**)P5091组和对照组的TME。(**H-M公司**)MDSC的百分比(**H（H）**)、特雷格(我)，CD4⁺T型(J型)，CD8⁺T型(**K（K）**)，Th1型(**L（左）**)和CTL(**M（M）**)在每组TME内。数据以平均值±SEM（n=7）表示(**电子邮箱**).

图3
**靶向USP7激活局部和全身抗肿瘤免疫。**(A类)P5091组和对照组TME中TAMs和CTL的多色免疫荧光检测。(**B-F公司**)细胞因子IFN-γ(B类)，肿瘤坏死因子-α(C类)，IL-2(天)，IL-5(电子)和IL-6(F类)通过Mul分析液流测定试剂盒检测各组TME中的T细胞。(**G-K公司**)Treg的比例(**G公司**)，CD4⁺T型(**H（H）**)，CD8⁺T型(我)，Th1型(J型)和CTL(**K（K）**)在各组脾脏中。数据以平均值±SEM（n=7）表示(**B-K公司**).

图4
**P5091介导的抑瘤作用和CTL激活是MΦ依赖性的。**(**A至B**)氯膦酸盐脂质体（Clo）消耗脾脏MΦs的效率验证(A类)和TME(B类). (C类)在经过各种指示的治疗后，对Lewis荷瘤小鼠的肿瘤生长进行了16天的监测。(天)显示各组TME中CTL比例的典型点图。(电子)点图中的汇总数据显示了TME中CTL的百分比。数据以平均值±SEM（n=7）表示(**C、 E类**).

图5
**以USP7为靶点可以激活p38 MAPK通路来重新编程TAM。**(A类)通过流式细胞术对TME中TAMs进行分选的策略。(B类)根据RNA测序结果绘制的热图显示了P5091组和对照组TAM中M1和M2相关基因的差异表达。(C类)RT-PCR进一步验证各组TAM的差异表达基因。数据表示为平均值±SEM（n=3）。(天)KEGG分析根据两组差异表达基因确定20条最明显富集的途径。(电子)Western blotting检测在指定时间点用P5091（10µM）处理的IL-4/13-BMDM M2细胞中JNK、p-JNK，ERK1/2，p-ERK1/2、p38、p-p38和β-actin的表达。(F类)流式细胞术分析CD8表面CFSE的表达⁺T细胞在IL-4/13条件培养基的存在下诱导各种指定治疗的BMDM M2细胞。治疗表明：DMSO刺激、P5091（10µM）刺激、在p38抑制剂（SB203580，10µM）、JNK（SP600125，10μM）、Erk1/2（U0126-EtOH，10μM）存在下的P5091刺激。数据以平均值±扫描电镜（n=4）表示。

图6
**联合阻断USP7和PD-1发挥协同抗肿瘤作用体内.**(A类)流式细胞术检测P5091（5µM或10µM）治疗后Lewis细胞中PD-L1的表达。数据表示为平均值±SEM（n=3）。(B类)用于检测Lewis TME中PD-L1表达的流式细胞术门控策略。(C类)流式细胞术定量P5091治疗后Lewis TME（ZIR活细胞）中PD-L1的表达。数据表示为平均值±SEM（n=6）。(天)联合使用P5091和PD-1抗体治疗Lewis荷瘤小鼠的治疗计划。(电子)用P5091和/或抗PD-1治疗Lewis肿瘤小鼠14天（n=13）。(F类)Kaplan-Meier生存图显示小鼠在指定治疗后的存活率（n=13）。

图7
**LUAD中USP7的表达与TCGA中的抗肿瘤免疫呈负相关。（A）**TCGA数据库中各种人类癌症（红色）、正常组织（蓝色）和转移组织（紫色）中USP7 mRNA的表达水平。(B类)USP7与先天性和T细胞介导的适应性抗肿瘤免疫之间的关系。GO:0048246，MΦ趋化性。GO:0042104，活化T细胞增殖的正向调节。GO:0001913，T细胞调节毒性。GO:0002227，粘膜固有免疫反应。GO:0032725，粒细胞MΦ集落刺激因子产生的正向调节。GO:0050778，免疫反应的正向调节。(C类)USP7表达与T细胞免疫和炎症免疫的相关性。(天)LUAD免疫调节相关成员的相关性。

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