In Mice Subjected to Chronic Stress, Exogenous cBIN1 Preserves Calcium-Handling Machinery and Cardiac Function

doi:10.1016/j.jacbts.2020.03.006

.2020年5月13日；5(6):561-578.

doi:10.1016/j.jacbts.2020.03.006。 eCollection 2020年6月。

在慢性应激小鼠中，外源性cBIN1保护钙处理机制和心脏功能

刘燕（Yan Liu）¹, 康周¹, 李静（音译）¹, Sosse Agvanian公司¹, 阿纳·马里亚·卡尔达鲁斯¹, Shaw先生¹, 塔拉·C·希兹曼², 罗宾·M·肖², 婷婷红^1 三

附属公司

¹斯密特心脏研究所，加利福尼亚州洛杉矶Cedars-Sinai医疗中心。
²犹他州盐湖城犹他大学Nora Eccles Harrison心血管研究与训练学院。
^三加利福尼亚州洛杉矶市Cedars-Sinai医疗中心和加州大学洛杉矶分校医学部。

PMID： 32613144
预防性维修识别码：项目管理委员会7315191
内政部： 2016年10月10日/j.jacbts.2020.03.006

在慢性应激小鼠中，外源性cBIN1保护钙处理机制和心脏功能

刘燕（Yan Liu）等人。 JACC基础翻译科学. 2020.

.2020年5月13日；5(6):561-578.

doi:10.1016/j.jacbts.2020.03.006。 eCollection 2020年6月。

作者

刘燕（Yan Liu）¹, 康周¹, 李静（音译）¹, Sosse Agvanian公司¹, 阿纳·马里亚·卡尔达鲁斯¹, 肖诚治¹, 塔拉·C·希兹曼², 罗宾·M·肖², 婷婷红^1 三

附属公司

¹斯密特心脏研究所，加利福尼亚州洛杉矶Cedars-Sinai医疗中心。
²犹他州盐湖城犹他大学Nora Eccles Harrison心血管研究与训练学院。
^三加利福尼亚州洛杉矶市Cedars-Sinai医疗中心和加州大学洛杉矶分校医学部。

PMID： 32613144
预防性维修识别码：项目管理委员会7315191
内政部： 2016年10月10日/j.jacbts.2020.03.006

摘要

心力衰竭是发病率和死亡率的一个重要且日益严重的原因。半数心力衰竭患者的射血分数保持不变，对他们来说治疗选择有限。在这里，我们报道了维持心肌细胞内亚细胞膜隔室的心脏桥接积分器1基因治疗可以稳定钙处理机制的细胞内分布，保护慢性β受体激动剂刺激和压力超负荷应激心脏的舒张功能。这项研究表明，维持细胞内结构，特别是t小管的膜微域，在交感神经应激的发生中很重要。膜微结构域的稳定可能是未来治疗发展的一条途径。

关键词：AAV9，腺相关病毒9；方差分析；AR，肾上腺素能受体；ATP酶、腺苷三磷酸酶；BW，体重；钙调素依赖性蛋白激酶；巨细胞病毒；4-[2-[6-（二辛胺基）-2-萘基]乙烯基]-1-（3-磺丙基）-吡啶的Di-8-ANNEP内盐；EC，兴奋收缩；舒张末期容积；EF，射血分数；绿色荧光蛋白；心力衰竭；心率；HT，杂合子；HW，心脏重量；ISO，异丙肾上腺素；LSD，差异最小；LTCC，电压依赖性L型钙通道；LV，左心室；LW，肺重量；PBS，磷酸盐缓冲盐水；PKA、蛋白激酶A；印尼国家电力公司，磷化氢；RWT，相对壁厚；RyR，ryanodine受体；SD，标准偏差；SEM，平均值标准误差；肌浆网钙ATP酶泵2a；SR，肌浆网；随机光学重建显微镜；TAC，主动脉横缩；透射电镜；野生型；cBIN1，心脏桥接积分器1；舒张功能障碍；心力衰竭；jSR，连接肌浆网；压力过载；交感超速；t小管；t小管，横小管；vg，载体基因组。

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数字

图1
外源性cBIN1减少ISO后小鼠心脏的同心圆肥大**（A）**实验方案：56只小鼠随机分为4个实验组：AAV9-GFP+PBS、AAV9-GFP+ISO、AAV9cBIN1+PBS和AAV9-cBIN1+ISO（n=14/组）。**（B）**将HW/BW小鼠分为4组。**（C）**PBS或ISO输注后4周，左心室舒张末期和收缩末期纵轴视图的代表性图像。舒张末期容积、左室重量和相对壁厚的超声心动图分析**（D）**，喷射分数**（E）**，E/E'**（F）**，冲程容积**（G）**，和心输出量**（H）**也包括在内。数据以平均值±SEM表示。使用双向方差分析，然后使用Fisher LSD检验进行多重比较。*在每个AAV9治疗组内PBS与ISO的比较中，p<0.05、***p<0.01和***p<0.001，在每个药物输注组内GFP与cBIN1的比较中，##p<0.01和##p<0.001。AAV9=腺相关病毒9；方差分析=方差分析；BW=体重；cBIN1=心脏桥接积分器1；GFP=绿色荧光蛋白；HW=心脏重量；ISO=异丙肾上腺素；LSD=最小显著差异；LV=左心室；PBS=磷酸盐缓冲盐水；SEM=平均值的标准误差。

图2
ISO减少cBIN1并破坏由AAV9-cBIN1标准化的cBIN1微折叠**（A）**心脏裂解物中cBIN1和GAPDH的蛋白印迹，以及GFP+PBS、GFP+ISO、cBIN1+PBS和cBIN1+ISO心脏的免疫沉淀心脏裂解物。右侧条形图中的量化（N=每组6-7个心脏）。**（B）**Di-8-ANNEP标记的代表性心肌细胞图像**（顶部面板）**（比例尺，10μm）和功率谱**（底部面板）**上面相应的方框感兴趣区域。峰值功率密度的量化包括在左边的条形图中（每组3到4个心脏的N=26到31个细胞）。数据以平均值±SEM表示。使用双向方差分析，然后使用Fisher LSD检验进行多重比较。*每个AAV9治疗组内PBS与ISO的比较p<0.05和**p<0.01#每个药物输注组内GFP与cBIN1的比较，p<0.05和##p<0.01。**（C）**所有4组（比例尺，1μm）心肌组织t小管（TT）微血管的透射电镜成像。每组TT轮廓度的量化包括在左边的条形图中（每组5-6个心肌切片和2-3个心脏的60-100张图像中的N=232-305 TT）。采用卡方检验比较各组间TT轮廓，GFP+PBS组与GFP+ISO组、GFP+ISO组与cBIN1+ISO组以及cBIN1+PBS与其他组的比较p<0.001。Di-8-ANNEPs=4-[2-[6-（二辛胺基）-2-萘基]乙烯基]-1-（3-磺丙基）-吡啶，内盐；GAPDH=3-磷酸甘油醛脱氢酶；TTs=t管；其他缩写如图1所示。

图3
cBIN1增加Cav1.2对t小管的定位**（A）**GFP+PBS、GFP+ISO、cBIN1+PBS和cBIN1+ISO心脏裂解物中Cav1.2的Western blot。定量（Cav1.2/GAPDH和Cav1.2/Troponin）包含在右侧的条形图中（每组n=5至7颗心脏）。**（B）**各组小鼠心肌中抗Cav1.2标记的代表性共焦图像（100×）**（顶部2个面板）**（比例尺，10μm）。第三个面板包括功率谱，第四个面板包括沿着心肌细胞纵轴的方框区域内的荧光强度剖面。各组t小管Cav1.2峰值功率密度和免疫荧光强度的定量总结在C类（n=15至32个细胞图像，每组3至4个心脏）。比例尺：10米。**（D）**各组典型钙瞬态示踪和峰值振幅定量（ΔF/F0）（每组6个心脏的61至88个细胞）。数据以平均值±SEM表示。使用双向方差分析，然后使用Fisher LSD检验进行多重比较每个AAV9治疗组的PBS与ISO比较p<0.001；^###每个药物输注组内GFP与cBIN1的比较p<0.001。缩写如图1和图2所示。

图4
cBIN1组织SERCA2a在ISO后心脏的细胞内分布**（A）**GFP+PBS、GFP+ISO、cBIN1+PBS和cBIN1+ISO心脏裂解物中SERCA2a的Western blot。**（B）**量化（SERCA2a/肌动蛋白）包括在条形图中（n=每组6至8个心脏）。**（C）**各组小鼠心肌中抗SERCA2a标记的典型共焦图像**（顶部2个面板）**.比例尺：10μm。这个**第三个面板**包括**装箱区**以上。(天)SERCA2a峰值功率密度的量化（n=11-15个细胞图像，每组3-4个心脏）。数据表示为平均值±SEM。使用双向方差分析，然后使用Fisher LSD检验进行多重比较。**每个AAV9治疗组内PBS与ISO的比较p<0.01和***p，0.001；^###每个药物输注组内GFP与cBIN1的比较p<0.001。缩写如图1所示。

图5
心脏微粒体的蔗糖梯度分级**（A）**GFP+PBS、GFP+ISO、cBIN1+PBS和cBIN1+ISO心脏微粒体F4（TT）部分Cav1.2和cBIN1的典型Western blot（每条通道装载2.5μg蛋白质）。量化包括在**条形图**（n=每组3个心脏）。**（B）**GFP+PBS、GFP+ISO、cBIN1+PBS和cBIN1+ISO心脏微粒体F2（纵向SR富集）和F3（jSR浓缩）组分中RyR、PLN和SERCA2a的代表性Western blot（每条通道装载25μg蛋白质）。F2和F3中SERCA2a的定量包括在**右侧条形图**（n=每组3个心脏）。数据表示为平均值±标准偏差。采用双向方差分析，然后采用Fisher LSD检验进行多重比较。*每个AAV9治疗组内PBS与ISO的比较，p<0.05、***p<0.01和***p<0.001#每个药物输注组内GFP与cBIN1的比较，p<0.05和##p<0.01。jSR=接合肌浆网；PLN=磷化氢；RyR=ryanodine受体；SD=标准偏差；SERCA2a=肌浆网钙ATP酶泵2a；其他缩写如图1所示。

图6
外源性cBIN1在心肌细胞超分辨率STORM成像和Cav1.2-RyR最近邻分析中结合Cav1.2/RyR和SERCA2a-cBIN1分子**（A和B，**视频1A,1B年,1摄氏度，以及一维)和SERCA2a-cBIN1（C和D，视频2A，以及2B型)从GFP+PBS、cBIN1+PBS和GFP+ISO心脏分离的心肌细胞中的分子。**（A、C）**自上而下，代表性的2-D STORM单元图像、代表性的耦合三维STORM图像，以及从全单元3-D STORM图像获得的最近邻距离分布直方图。**（B、D）**使用全细胞图像分析量化最近邻距离分布直方图的第一个峰值（每组2-3只动物的N=7至17个细胞）。数据以平均值±SEM表示。使用双向方差分析，然后进行Fisher LSD检验进行多重比较。*每个AAV9治疗组的PBS与ISO比较p<0.05#在每个药物输注组中，GFP与cBIN1的比较分别为p＜0.05和#p＜0.001。STORM=随机光学重建显微镜；其他缩写如图1和图5所示。

在线视频1AGFP+PBS分离的心肌细胞中Cav1.2（红色）/RyR（绿色）耦合蛋白的代表性三维（3D）STORM图像(A类)，cBIN1+PBS(B类)，GFP+ISO(C类)，或cBIN1+ISO(天)红心。

在线视频1BGFP+PBS分离的心肌细胞中Cav1.2（红色）/RyR（绿色）耦合蛋白的代表性三维（3D）STORM图像(A类)，cBIN1+PBS(B类)，GFP+ISO(C类)，或cBIN1+ISO(天)红心。

在线视频1CGFP+PBS分离的心肌细胞中Cav1.2（红色）/RyR（绿色）耦合蛋白的代表性三维（3D）STORM图像(A类)，cBIN1+PBS(B类)，GFP+ISO(C类)，或cBIN1+ISO(天)红心。

在线视频1D从GFP+PBS分离的心肌细胞中Cav1.2（红色）/RyR（绿色）偶联子的代表性三维（3D）STORM图像(A类)，cBIN1+PBS(B类)，GFP+ISO(C类)，或cBIN1+ISO(天)红心。

在线视频2AGFP+PBS分离的心肌细胞中SERCA2a（绿色）/cBIN1（红色）耦合子的典型三维（3D）STORM图像(A类)，cBIN1+PBS(B类)，GFP+ISO(C类)，或cBIN1+ISO(天)红心。

在线视频2BGFP+PBS分离的心肌细胞中SERCA2a（绿色）/cBIN1（红色）耦合子的典型三维（3D）STORM图像(A类)，cBIN1+PBS(B类)，GFP+ISO(C类)，或cBIN1+ISO(天)红心。

图7
接收AAV9-GFP、cBIN1、BIN1、BAN1+17和BIN1+13的ISO后心脏超声心动图**（A）**各组在基线检查时的典型左心室短轴M型图像**（顶部）**ISO处理后4周**（底部）**在所有为期4周的ISO后图像中，乳头肌用箭头标记**（B至D）。**左心室质量的定量分析**（B）**，相对壁厚**（C）**，和射血分数**（D）**每组10只小鼠。**（E）**代表性二尖瓣流入脉冲波多普勒图像**（顶部）**ISO治疗4周后二尖瓣间隔环的组织多普勒图像**（底部）**.（F至H）E/E’的定量分析**（F）**，冲程容积**（G）**和心输出量**（H）**每组10只小鼠。数据表示为平均值±SEM。使用双向方差分析，然后使用Fisher LSD检验进行多重比较。*与基线相比，p<0.05，***p<0.01，***p<0.001#ISO后4周，与GFP组相比，p<0.05、##p<0.01和###p<0.001。缩写如图1所示。

图8
cBIN1基因转移提高TAC后小鼠的无心力衰竭存活率**（A）**TAC研究方案示意图。**（B）**术后5天对所有小鼠进行跨主动脉压力梯度测量。**（C）**WT组与对照组心衰无存活率（非存活率为死亡或EF<35%）的Kaplan-Meier生存曲线。*垃圾箱1*HT小鼠**（左）**和AAV9-GFP或cBIN1预处理小鼠**（右）**生存率比较采用对数秩和检验。硬件/硬件**（D）**和LW/BW（E）在TAC后8周的所有小鼠中。(F类)术后8周所有小鼠的典型M型超声心动图。超声心动图测量的左心室射血分数**（G）**，舒张末期容积**（H）**，LV质量**（一）**和E/E'**（J）**所有小鼠在TAC后8周。数据表示为平均值±SEM。包括AAV9治疗组中具有代表性的E和E'图像**（J的右面板）**.未付款学生的*t吨-*测试（或用于比较WT和*垃圾箱1*HT。在Sham、AAV9-GFP和AAV9-cBIN1之间进行比较时，使用单向方差分析或Kruskal-Wallis检验，然后使用Fisher-LSD检验进行多重比较。*与WT或Sham相比，p<0.05、***p<0.01和***p<0.001#AAV9-GFP与AAV9-cBIN1的比较，p<0.05和##p<0.01。EF=射血分数；HT=杂合子；LW=肺重量；TAC=主动脉横缩；WT=野生型；其他缩写如图1所示。

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中的注释

心脏BIN1替代治疗通过调节钙处理改善心力衰竭患者的肌力和视力。
Gambardella J、Wang XJ、Ferrara J、Morelli MB、Santulli G。 Gambardella J等人。 JACC基础翻译科学。2020年6月22日；5(6):579-581. doi:10.1016/j.jacbts.2020.03.018。eCollection 2020年6月。 JACC基础翻译科学。2020 PMID：32614937 免费PMC文章。

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1. Verloop W.L.、Beeftink M.M.、Santema B.T.关于交感神经系统与左室射血分数保持的心力衰竭之间关系的系统综述。公共科学图书馆一号。2015;10-项目管理咨询公司-公共医学
1. Nikolaev V.O.、Moshkov A.、Lyon A.R.Beta2-肾上腺素能受体在心力衰竭中的再分配改变了cAMP的分区。科学。2010;327:1653–1657.-公共医学
1. Ibrahim M.、Gorelik J.、Yacoub M.H.、Terracciano C.M.《心脏t管的结构和功能与健康和疾病》。过程生物科学。2011;278:2714–2723.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Schobesberger S.、Wright P.、Tokar S.，在心力衰竭进展期间，T小管重塑干扰了大鼠心室肌细胞中的局部β2肾上腺素能信号。2017年心血管研究；113:770–782.-项目管理咨询公司-公共医学

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[6] Nikolaev V.O.、Moshkov A.、Lyon A.R.Beta2-肾上腺素能受体在心力衰竭中的再分配改变了cAMP的分区。科学。2010;327:1653–1657.-公共医学

[7] Ibrahim M.、Gorelik J.、Yacoub M.H.、Terracciano C.M.《心脏t管的结构和功能与健康和疾病》。过程生物科学。2011;278:2714–2723.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Ibrahim M.、Gorelik J.、Yacoub M.H.、Terracciano C.M.《心脏t管的结构和功能与健康和疾病》。过程生物科学。2011;278:2714–2723.-项目管理咨询公司-公共医学

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