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.2020年6月9日；31(10):107751.
doi:10.1016/j.celrep.2020.107751。

组蛋白H3K36甲基化状态在转录调控功能中的独特和共同作用

朱莉娅·迪菲奥雷 1, 特拉维斯·S·普塔切克 2, 王毅（Yi Wang） 三, 李冰冰 4, 杰里米·西蒙 5, 布莱恩·德·斯特拉尔 6
附属机构

组蛋白H3K36甲基化状态在转录调控功能中的独特和共同作用

朱莉娅·迪菲奥雷等。 单元格代表. .

摘要

Set2共转录甲基化组蛋白H3（H3K36）的赖氨酸36，产生单甲基化、二甲基化和三甲基化（H3K 36me1/2/3）。这些修饰招募或排斥对转录保真度、mRNA剪接和DNA修复至关重要的染色质效应蛋白。然而，尚不清楚H3K36的不同甲基化状态是否具有不同的生物学功能。在这里，我们使用产生不同赖氨酸甲基化状态的Set2工程形式来识别H3K36修饰的独特和共享功能。虽然H3K36me1/2和H3K365me3在许多SET2缺失表型中功能冗余，但我们发现H3K36 me3具有与Bur1激酶活性和FACT（促进染色质转录）复合物功能相关的独特功能。此外，在营养胁迫期间，H3K36me1/2或H3K365me3抑制来自基因内的高水平组蛋白乙酰化和隐性转录。我们的发现揭示了不同H3K36甲基化状态对不同染色质功能的调节潜力。

关键词：H3K36甲基化；RNA聚合酶Ⅱ；第二组；染色质；隐秘转录；表观遗传学；组蛋白；营养胁迫；转录调控。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明B.D.S.承认他是EpiCypher，Inc.的联合创始人和科学顾问委员会成员。

数字

图1。
图1.Set2中的Phe/Tyr开关分离H3K36甲基化状态在体外
（A） 突出显示Phe/Tyr开关的Y149和F234残基的Set2的结构域图。Set2的催化区域由与SET相关联的（AWS）、催化SET域和后SET（PS）组成。自抑制域（AID）调节催化活性。Set2的C末端具有蛋白质相互作用域，如卷曲-卷曲（CC）、WW和Set2-Rpb1（SRI）蛋白相互作用域。（B） 结合到H3肽（板岩）和SAM（黄色、白色、蓝色和红色球体）的Set2 SET域（黄色）模型，突出显示形成Phe/Tyr开关的F234（浅紫色）和Y149（深紫色）的位置。H3K36为绿色，甲基化显示为白色、浅粉红色和深粉红色。橙色球体是催化所必需的锌离子。（C） 重组Set2和Phe/Tyr开关突变蛋白的考马斯染色。未显示的通道是以下实验中未使用的其他纯化蛋白质。（D） 蛋白质斑点在体外使用所示抗体进行组蛋白甲基转移酶（HMT）分析。体外HMT分析使用来自昆虫细胞的等量重组Set2和Phe/Tyr开关突变蛋白，重组爪蟾核小体和辅因子SAM。HeLa LONs（长寡核苷酸）被用作免疫印迹的阳性对照。
图2。
图2.Set2中的Phe/Tyr开关突变是分离H3K36甲基化状态的工具在体内
（A） 用Set2和不同的H3K36me抗体检测酵母菌株的Western blot。S、 短期暴露；五十、 长期接触。G6PDH和H3用作装载控制。（B） 所示菌株中Set2的定量标准化为G6PDH。突变体的数据相对于BY4742进行了归一化。（C–E）所示菌株中归一化为H3的H3K36me3（C）、H3K365me2（D）和H3K36.me1（E）的量化。H3K36me1用短时间暴露的western blot定量。所有突变体的测量值均按BY4742标准化。每个柱状图代表两个或多个独立生物复制品的平均值±SEM，具有（a）中所示的代表性复制品。
图3。
图3不同甲基化形式的H3K36沉积在基因转录区内或附近
（A） 的示意图蒸汽发生器11放大器如下所示。（B–D）H3K36me3、H3K3.6me2和H3K365me1的ChIP分析STE11型在指示菌株中。（B）中的图例代表了图中所示的所有数据。（E）项目管理A1放大器如下所示。H3K36me3、H3K36me2和H3K36me1的（F–H）ChIP分析项目管理A1在指示菌株中。（一） 的示意图TDH3型放大器如下所示。（J–L）H3K36me3、H3K36.me2和H3K3.6me1的ChIP分析时间差3在指示菌株中。数据表示为三个独立生物复制的平均值±SEM。采用Student t检验获得p值。星号表示显著性（*p<0.05；**p<0.01）；未显示无意义的比较。表S3列出了所有qPCR引物。
图4。
图4 H3K36me1/2和H3K365me3在某些细胞环境中具有独特的表型
（A） BY4742的五倍系列稀释液，设置2Δ、和集合2在含有咖啡因（15 mM）、雷帕霉素（25 nM）或韧皮霉素（10μg/mL）的YPD或YPD上培养的突变菌株。（B） BY4742的五倍系列稀释液，设置2Δ、和集合2在含有DMSO或200μg/mL 6-AU的SC-Ura上电镀的突变菌株。（C）五倍的BY4741系列稀释液，bur1Δ、和集合2在含有5-氟尿酸（5-FOA）的SC-Ura-Leu或SC-Ura-Leu上电镀的突变菌株。（D） W303的五倍系列稀释液，第16–11页、和集合2将突变菌株镀在SC-Leu上，并在25°C或34°C下培养。（E） 的示意图FLO8-HIS3系列融合基因报告子检测隐秘转录。（F） 的示意图STE11-HIS3型检测隐性转录的融合基因报告子。（G） 指示WT的五倍系列稀释，设置2Δ、和集合2在SC-Ura、含有2%半乳糖的SC-Ura-His或SC-Ura-His上电镀的突变菌株。所有斑点分析重复三次，显示的图像代表了数据。
图5。
图5 H3K36甲基化状态在隐秘转录调控中的作用
（A） 在之前定义的439个高（蓝色）和中（红色）置信度隐秘起始位点（CIS）上，正反义标准化转录信号（百万分之读数）。信号在三个独立的生物复制中平均，并在每个遗传模型营养剥夺后0分钟（顶部）和60分钟（底部）绘制。将每条线的最小值调整为0（y轴），以调整基线表达的细微差异，并关注信号大小的位置和范围（见McDaniel等人，2017）。（B） 反义转录热图，绘制为集合2营养剥夺后60分钟的突变体和WT（突变体-WT）。对之前显示的在CIS和转录起始位点之间有反义转录的92个基因绘制了标准化信号图。较深的灰色表明突变体中的反义信号比WT中的多。基因体外部的区域被蓝色掩盖。（C） 439个高自信和中等自信CIS的CIS和转录起始位点之间基因区域平均碱基覆盖率的正、反义信号差异散点图（突变-WT）。每个点代表给定基因的CIS；延伸到左上象限的点表示感觉转录减少（相对于WT），同时反义转录增加。位于该象限的所有439个基因的百分比显示在每个面板的左上角。（D） 显示（C）左上象限中基因重叠的UpSet图。总共有143个基因在所有四个基因中表现出与WT相关的反义偏斜集合2突变体。（E） 在439个CIS周围的100 bp中发现了显著富集的序列基序，需要相对于局部背景序列至少2倍的富集。
图6。
图6全球H3K27ac和H3K56ac的变化集合2甲基化突变体
（A） 用Set2、H3K36me1、H3K 36me2、H3 K36me3、H3 K 27ac和H3 K56ac抗体探测指示菌株的蛋白质印迹。G6PDH和H3用作装载控制。（B和C）H3K27ac（B）和H3K56ac（C）的量化归一化为H3。所有测量值在0分钟时相对于BY4742进行标准化。每个条形图代表两个或多个独立生物复制品的平均值±SEM，具有（a）中所示的代表性复制品。
图7。
图7 H3K36me1/2和H3K365me3对于正确定位H3K27ac非常重要
（A） 的示意图STE11型扩增子如下所示。预测的CIS位于引物集4内。H3K27ac的（B–E）ChIP分析STE11型在指定的菌株和时间点。（F） 的示意图SPB4级放大器如下所示。预测的CIS位于引物组5内。（G–J）H3K27ac的ChIP分析SPB4级在指定的菌株和时间点。数据表示为两个独立生物复制的平均值±SEM。采用Student t检验获得p值。星号表示显著性（*p<0.05；**p<0.01）；未显示无意义的比较。表S3列出了所有qPCR引物。
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