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。2020年6月2日；31（6）：1091-1106.e6。
doi:10.1016/j.cmet.2020.04.017。 Epub 2020年5月18日。

铜绿假单胞菌利用宿主衍生衣康酸重定向代谢促进生物膜形成

塞巴斯蒂安·里克尔梅 1, 卡勒·利亚马塔 1, Tania Wong Fok Lung黄火龙 1, 布兰奇油田 1, 丹妮尔·安 1, 大卫·陈 1, 卡门·洛扎诺 2, 尤兰达·桑兹 2, 安妮·卡汀·乌勒曼 3, 芭芭拉·卡尔 4, 克莱门特·布里托 5, 艾米莉·迪芒戈 3, 爱丽丝·普林斯 6
附属公司

铜绿假单胞菌利用宿主衍生衣康酸重定向代谢促进生物膜形成

塞巴斯蒂安·里克尔梅等。 单元格元。 。

摘要

铜绿假单胞菌尤其具有致病性，常与顽固性肺炎和高死亡率相关。铜绿假单胞菌如何避免免疫清除，并在炎症的人类气道中持续存在，目前尚不清楚。在本研究中，我们表明铜绿假单胞菌可以利用宿主免疫反应来维持感染。值得注意的是，与其他条件致病菌不同，我们发现铜绿假单胞菌改变了其代谢和免疫刺激特性，以响应衣康酸，衣康酸是受感染肺中丰富的宿主衍生免疫代谢物。衣康酸诱导细菌膜应激，导致脂多糖（LPS）下调和胞外多糖（EPS）上调。这些衣康酸适应的铜绿假单胞菌积累lptD突变，有利于衣康酸同化和生物膜形成。EPS反过来诱导气道和全身髓细胞产生衣康酸，使宿主免疫反应偏向一种允许的慢性感染。因此，在设计治疗方案时需要考虑铜绿假单胞菌的代谢多样性。

关键词：细菌代谢；生物膜；囊性纤维化；胞外多糖；免疫代谢；炎症；衣康酸盐；脂多糖；肺炎；铜绿假单胞菌。

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利益声明作者声明没有竞争利益。

数字

图1。
图1。
的代谢偏好铜绿假单胞菌在气道中。一个)显示新陈代谢如何调节胞外多糖（EPS）（红盒）和脂多糖（LPS）（蓝盒）的合成和运输的方案铜绿假单胞菌图中还显示了衣康酸代谢（灰框）、TCA循环活性（黄圈）和葡萄糖分解代谢（橙绿框）。葡萄糖新生通量如红色箭头所示。B类)与各自的对照组相比（倍数增加），参与EPS和LPS生成的不同基因的表达P.阿鲁银杏分离物来自小鼠和人类。C类)用Mass-Spec测定感染小鼠气道琥珀酸、衣康酸和葡萄糖的丰度铜绿假单胞菌PAO1或17个CF主机的集合铜绿假单胞菌分离物。PBS治疗小鼠为对照组。从n=2个独立实验中收集4-5只小鼠。D类)每种产品的隔夜增长翻倍铜绿假单胞菌琥珀酸相关菌株：实验室菌株、ICU和CF分离物来自不同的受试者。E类)铜绿假单胞菌流式细胞术测定的膜电位生物活性炭轻型DiOC2（3） 使用或不使用衣康酸（1:1）进行过夜葡萄糖培养后进行染色。膜电位解偶联剂CCCP用于染色特异性阳性对照30min。F类)PAO1的LPS提取物在葡萄糖或葡萄糖和衣康酸盐（1:1）中培养过夜，并对O抗原和核心进行染色。大肠杆菌LPS：阳性对照。仅就葡萄糖而言，用FIJI定量葡萄糖和衣康酸中生长的PAO1的核心、核心+1和O抗原LPS带强度。G公司)与仅在葡萄糖中生长的PAO1相比，参与EPS和LPS合成的基因在葡萄糖和衣康酸中生长的倍数增加。C、 E类：单向方差分析；F类：学生的吨-测试。数据显示为平均+/-SEM。D-G公司表示至少n=3.****：P（P）< 0.0001; ***:P（P）< 0.001; **:P（P）< 0.01; *:P（P）< 0.05; ns：无显著性。另请参见图S1。
图2。
图2。
Δ低压配电盘4213 PAO1诱导呼吸道巨噬细胞衣康酸代谢。A至C)海马（A）、线粒体活性氧（O）的细胞外酸化率（ECAR）2*−)通过Mitosox和流式细胞术（B）测定，以及Seahorse（C）测定未感染（PBS）或感染PAO1或Δ液化石油气4213 PAO1。D类)未感染（PBS）或16小时经鼻感染PAO1或Δ的小鼠BAL中炎症细胞因子IL-1β（左）、IL-6（中）和TNFα（右）的水平液化石油气4213 PAO1。E-F公司)的OCR（E）和ECAR（F）爱尔兰1+/+和爱尔兰1−/−未感染（PBS）或感染Δ的BMDM液化石油气4213 PAO1。G公司)小鼠按D感染，衣康酸通过BAL中的Mass Spec定量。H（H）)关于WT PAO1，Δ液化石油气4213 PAO1在不同碳源中隔夜增长了一倍。I-J公司)PAO1和Δ产生的结晶紫生物膜液化石油气4213株PAO1菌株在添加衣康酸或琥珀酸的M9中生长。K（K）)细菌负荷（CFU）测量单位：爱尔兰1+/+和爱尔兰1−/−Δ感染小鼠的肺部液化石油气4213人。L（左）)Δ中EPS和LPS合成相关基因的倍增液化石油气4213 PAO1，关于PAO1。数据显示为平均+/-SEM。B、 D、G：单向方差分析；K（K）：t-学生；A、 C、E-F、I-J：双向方差分析。体内数据来自n=2（总共6-7只小鼠）。海马的最小值为n=3。****：P（P）< 0.0001; ***:P（P）<0.001；**：P（P）< 0.01; *:P（P）< 0.05; ns：无显著性。另请参见图S2。
图3。
图3。
铜绿假单胞菌EPS褐藻酸盐诱导抗氧化剂衣康酸代谢。A-D公司)海马的细胞外酸化率（ECAR）（A）和耗氧率（OCR）（B）以及线粒体膜电位ΔΨ（C） 和线粒体ROS（O2*−)（D）通过流式细胞术对未经治疗（PBS）或经藻酸盐或LPS治疗的小鼠BMDM进行检测。E-H公司)ECAR（E）、OCR（F）、ΔΨ（G） 和O2*−用PBS、WT PAO1或Δ处理的小鼠BMDM中的水平（H）algD公司PAO1.数据显示为平均+/-SEM。C类-D类,G公司-H（H）：单向方差分析。海马和流式细胞术实验的最小值为n=3.****：P（P）< 0.0001; ***:P（P）< 0.001; **:P（P）< 0.01; *:P（P）<0.05；ns：无显著性。另请参见图S3。
图4。
图4。
铜绿假单胞菌海藻酸EPS诱导气道衣康酸并防止细胞死亡。A-D公司)DAPI百分比+流式细胞术检测肺泡巨噬细胞（死亡细胞）（A）、肺泡巨噬细胞数量（左）、Ly6C高赖氨酸6G−流式细胞术（B）检测BAL中单核细胞（中部）和中性粒细胞（右侧），ELISA检测促炎IL-1β（左侧）、IL-6（中部）、TNFα（右侧）细胞因子（C），Mass Spec检测衣康酸（D）检测PAO1 WT或ΔalgD公司PAO1。E类)BAL中的促炎性IL-1β（左）、IL-6（中）和TNFα（右）细胞因子爱尔兰1+/+和爱尔兰1−/−用PBS处理或用PAO1感染的小鼠。数据显示为平均+/-SEM。A-E公司：单向方差分析；数据来自n=2（总共7-8只小鼠）。****：P（P）< 0.0001; ***:P（P）< 0.001; **:P（P）< 0.01; *:P（P）< 0.05; ns：无显著性。另请参见图S3。
图5。
图5。
糖酵解通量减少有助于通过铜绿假单胞菌。一个)与各自的对照组相比（增加了倍），参与葡萄糖分解代谢的不同基因在P.阿鲁银杏分离物来自小鼠和人类。B类)Zwf公司通过qRT-PCR测定暴露于或不暴露于衣康酸的M9+葡萄糖喂养的PAO1中的mRNA水平（n=3）。C-E公司)Biolog平板的能量生产（C）、LB（D）中不同衣康酸浓度下的细菌生长和磷酸葡萄糖酸脱氢酶,信息通信技术,脑出血和ccl公司Δ中qRT-PCR（E）的mRNA水平磷酸葡萄糖酸脱氢酶PAO1及其补体Δ磷酸葡萄糖酸脱氢酶PAO1 Comp控制，尊重WT PAO1。F-G公司)ELISA（F）测定的促炎性IL-1β（左）、IL-6（中）和TNFα（右）细胞因子，以及肺泡巨噬细胞（左）和Ly6C高的赖氨酸6G−单核细胞（中间）和Ly6C高/低赖氨酸6G+流式细胞术（G）检测未经治疗（PBS）或感染Δ16h小鼠BAL中性粒细胞（右）数量磷酸葡萄糖酸脱氢酶PAO1或其Δ磷酸葡萄糖酸脱氢酶PAO1补充控制。数据显示为平均+/-SEM。B、 E、F-G：t-学生。D类：双向方差分析。体内数据来自n=2（共8只小鼠）。****：P（P）< 0.0001; ***:P（P）< 0.001; **:P（P）< 0.01; ns：无显著性。另请参见图S4。
图6。
图6。
主机自适应铜绿假单胞菌分离株利用宿主衣康酸在呼吸道定植。一个)在17个集合中发现的非同义SNP数量铜绿假单胞菌与PAO1基因组相比。分析途径：LPS-EPS生物合成-运输和衣康酸分解代谢。B类)通过qRT-PCR对两个具有代表性的PAO1进行折叠增加基因表达铜绿假单胞菌来自A的分离物：类粘液605和小菌落变体686。C类)Ict-ich-ccl公司qRT-PCR在不同ICU和CF中的位点表达铜绿假单胞菌与PAO1有关的分离物。D类)PA605类粘液菌株的抗体。E-H公司)在葡萄糖（E-F）或琥珀酸（G-H）存在下，衣康酸通过黏液605介导生物膜和生长铜绿假单胞菌及其等基因Δ信息通信技术突变体。I-J公司)细菌负荷（CFU）发现于爱尔兰1+/+和爱尔兰1−/−未经治疗（PBS）或感染CF分离物（I）和PAO1（J）的小鼠的肺和BAL。K（K）)17例CF感染者的IL-1β水平爱尔兰1+/+和爱尔兰1−/−BAL。数据显示为平均+/-SEM。B类：单向方差分析；I-K公司：t-学生。体内数据来自n=2（总共7-8只小鼠）。****：P（P）< 0.0001; ***:P（P）<0.001；**：P（P）< 0.01; *:P（P）< 0.05; ns：无显著性。另请参见图S5和图S6。
图7。
图7。
产生IRG1的气道髓细胞饲料铜绿假单胞菌隔离感染。A-D公司)Ly6C的代表性密度图高的赖氨酸6G−和Ly6C低的赖氨酸6G−单核细胞群（A）及其在总Ly6C中的各自百分比+赖氨酸6G−人口（B）和Irg1的百分比+赖氨酸6C高的赖氨酸6G−用PBS、PAO1或17CF的集合处理的小鼠的BAL中的群体（C-D）铜绿假单胞菌分离物。E-F公司)流式细胞术检测健康受试者（HS）和CF患者痰液中表达CD14和/或CD16表面标记的代表性密度图（E）和细胞频率（F）。G公司)肺泡巨噬细胞数量（CD14+CD16型+E）在痰中发现及其IRG1表达。H-I公司)CD14编号+CD16型−痰中发现的单核细胞（如E所示）及其IRG1表达。J型)健康受试者（HS）和CF患者的唾液代谢组学。数据显示为平均+/-SEM。B类,D类,G、 H、I：t-学生。体内数据来自n=2（共5只小鼠）。在G、 H（H）和J型每个点代表一个患者。****：P（P）< 0.0001; ***:P（P）< 0.001; *:P（P）< 0.05; ns：无显著性。另请参见图S7。
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