PTPN23 binds the dynein adaptor BICD1 and is required for endocytic sorting of neurotrophin receptors

doi:10.1242/jcs.242412

。2020年3月30日；133（6）：jcs242412。

doi:10.1242/jcs.242412。

PTPN23结合动力蛋白适配器BICD1，是神经营养素受体内吞分选所必需的

Marta I Budzinska公司¹, 大卫·维拉罗埃尔·坎波斯¹, 马修·戈尔丁², 安妮·韦斯顿^三, 露西·科林森^三, 安布罗修斯·斯尼德斯⁴, 詹皮etro斯齐亚沃^5 6 7

附属公司

¹伦敦大学学院皇后广场神经病学研究所神经肌肉疾病系，伦敦WC1N 3BG，英国。
²威廉·哈维研究所，伦敦玛丽女王大学，英国伦敦EC1M 6BQ。
^三电子显微镜，Francis Crick Institute，1 Midland Road，London NW1 1ST，UK。
⁴蛋白质组学科学技术平台，Francis Crick Institute，1 Midland Road，London NW1 1ST，UK。
⁵伦敦大学学院伦敦皇后广场神经病学研究所神经肌肉疾病系，英国伦敦WC1N 3BGgiampietro.schiavo@ucl.ac.uk。
⁶英国伦敦大学学院英国痴呆研究所，英国伦敦WC1E 6BT。
⁷英国伦敦WC1N 3BG大学学院伦敦校区再生和精确医学发现中心。

PMID： 32079660
预防性维修识别码： PMC7132798型
内政部： 10.1242/jcs.242412

PTPN23结合动力蛋白适配器BICD1，是神经营养素受体内吞分选所必需的

Marta I Budzinska公司等。细胞科学杂志。 2020。

。2020年3月30日；133（6）：jcs242412。

doi:10.1242/jcs.242412。

作者

Marta I Budzinska公司¹, 大卫·维拉罗埃尔·坎波斯¹, 马修·戈尔丁², 安妮·韦斯顿^三, 露西·科林森^三, 安布罗西斯·斯奈德斯⁴, 詹皮etro斯齐亚沃^5 6 7

附属公司

¹伦敦大学学院皇后广场神经病学研究所神经肌肉疾病系，伦敦WC1N 3BG，英国。
²威廉·哈维研究所，伦敦玛丽女王大学，英国伦敦EC1M 6BQ。
^三电子显微镜，Francis Crick Institute，1 Midland Road，London NW1 1ST，UK。
⁴蛋白质组学科学技术平台，Francis Crick Institute，1 Midland Road，London NW1 1ST，UK。
⁵伦敦大学学院伦敦皇后广场神经病学研究所神经肌肉疾病系，英国伦敦WC1N 3BGgiampietro.schiavo@ucl.ac.uk。
⁶英国伦敦大学学院英国痴呆研究所，英国伦敦WC1E 6BT。
⁷英国伦敦WC1N 3BG大学学院伦敦校区再生和精确医学发现中心。

PMID： 32079660
预防性维修识别码： PMC7132798型
内政部： 10.1242/jcs.242412

摘要

靶向源性神经营养素的信号传递对于神经系统的正确发育和终身维持至关重要。多年来，有关神经营养素及其受体的生命周期的几个方面已经被描述出来，包括信号相容性配体-受体复合物的形成、内吞和运输。然而，指导活性神经营养素受体分类的分子机制仍不清楚。此前，我们的实验室确定了一种动力蛋白运动适配器Bicadal-D1（BICD1），它是脑源性神经营养因子（BDNF）激活的TrkB（也称为NTRK2）和p75溶酶体降解的关键因素^NTR公司（也称为NGFR）。这里，我们使用蛋白质组学方法，在BICD1相互作用组中鉴定了蛋白质酪氨酸磷酸酶，非受体类型23（PTPN23），它是运输（ESCRT）机械所需的内体分选复合体的成员。分子定位显示PTPN23不是典型的BICD1货物；相反，PTPN23结合BICD1的N末端，这对细胞质动力蛋白的募集也至关重要。根据BICD1敲除表型，PTPN23的缺失导致BDNF激活的p75的积累增加^NTR公司以及TrkB在肿胀的空泡样腔室中的表达，表明神经元PTPN23是神经营养素受体内吞分选的新调节器。

关键词：细胞内分选；运动神经元；贩卖人口；TrkB；第75页NTR。

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利益冲突声明

竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

**图1。**
**PTPN23共免疫沉淀物和** **共同定位** **在运动神经元和神经元细胞系中具有BICD1。**（A）使用蛋白G磁珠对N2A-FLAG-TrkB细胞裂解物进行联合免疫沉淀，预涂有亲和纯化抗BICD1多克隆抗体或兔IgG作为对照。使用抗PTPN23和抗BICD1抗体对免疫沉淀物进行免疫印迹显示内源性PTPN23与BICD1的特异性联合免疫沉淀(n个=5). （B） N2A-FLAG-TrkB细胞的共焦图像，使用抗BICD1和抗PTPN23抗体进行固定和免疫染色。BICD1富含细胞突起（箭头），而PTPN23在细胞表面附近富集（箭头）。BICD1和PTPN23在核周区（插图）高度丰富，免疫染色部分重叠(n个=6). 比例尺：10μm；嵌入：5μm。（C） ES-MN的共聚焦图像，固定并免疫染色BICD1、PTPN23和神经元标记物βIII-管蛋白，显示BICD1和PTPN23的部分重叠和核周富集(n个=3). 比例尺：10μm。（D） ES-MN的共焦图像。细胞饥饿，用或不用BDNF刺激1小时，固定并免疫染色BICD1和PTPN23(n个=2). 比例尺：10μm。（E）使用曼德系数量化BICD1和PTPN23共定位（来自D）。每种情况下14个神经元的分析；*P（P）*>0.05，学生的吨-测试（ns，不显著）。

**图2。**
**BICD1和PTPN23直接相互作用体外。**（A） BICD1结构域架构的示意图，描述其螺旋结构域（CC1–CC3），并强调dynein、dynactin、Rab6和RanBP2的已知结合区域。下面是GST-BICD1片段的示意图，带有预测的分子量（MW；kDa）。GST-BICD1蛋白在GST下拉中红色结合HA-PTPN23。（B）预先装载GST重组蛋白的GSH树脂与含有过表达HA-PTPN23的N2A-FLAG-TrkB细胞裂解物孵育(n个=2). GST下降后，使用抗HA抗体通过免疫印迹法评估洗脱蛋白。BICD1-CC1型^95-265是沉淀HA-PTPN23的最短片段(n个=6). （C） PTPN23域体系结构和His的示意图₆-用于GST下拉的PTPN23片段，预测MW。His₆-红色结合GST-BICD1中的PTPN23蛋白。（D） GST-CC1预载GSH树脂^95-265或GST与含有His的细菌细胞提取物孵育₆-PTPN23片段(n个=3). 用抗-His的免疫印迹法洗脱并评估下拉蛋白₆抗体。

**图3。**
**绿色荧光蛋白-BICD1^Δ95-265显示与PTPN23的关联减少。**（A）用于共同免疫沉淀和共焦显微镜的GFP-BICD1蛋白示意图。（B）用编码HA-PTPN23和GFP-BICD1的质粒转染N2A-FLAG-TrkB细胞过夜^重量或GFP-BICD1^Δ95-265以及使用GFP-trap珠进行联合免疫沉淀的细胞提取物(n个=1). 使用抗HA和抗GFP抗体通过免疫印迹法评估洗脱蛋白，揭示突变GFP-BICD1之间的结合减少^Δ95-265和HA-PTPN23，相对于GFP-BICD1^重量（C）用表达HA-PTPN23和GFP-BICD1变体或GFP的质粒转染N2A-FLAG-TrkB细胞过夜，并用抗HA抗体进行固定和免疫染色(n个=3). 绿色荧光蛋白-BICD1^重量和GFP-BICD1^95至265（见插图）与HA-PTPN23（箭头）共定位，而聚合型GFP-BICD1^Δ95-265转移到细胞外围（箭头）。图像显示最大强度Z轴-堆叠投影，以0.5μm的间距采集；插图显示了从相应的Z轴-堆栈。比例尺：10μm，插入：5μm。

**图4。**
**PTPN23与含有TrkB的内吞小泡相关。**N2A-FLAG-TrkB细胞中抗TrkB抗体积聚试验的共焦图像。用抗体培养细胞30分钟，用100 ng/ml BDNF追踪细胞30分钟。酸洗和固定后，使用抗PTPN23抗体和Alexa Fluor 488-共轭二级抗体对细胞进行免疫染色。Alexa Fluor 555结合二级抗体用于揭示TrkB的定位(n个=1). 比例尺：10μm；嵌入：5μm。

**图5。**
**PTPN23对于保持NTR的稳态水平并不重要。**（A）用打乱或PTPN23-KD shRNAs转导N2A-FLAG-TrkB细胞72小时。对细胞裂解物进行PTPN23和NTR以及相关蛋白的免疫印迹。使用GAPDH作为负荷控制，并评估GFP慢病毒报告基因的水平(n个=3). （B）归一化为GAPDH的A蛋白水平的密度分析(n个=3). ***P（P）*<0.01，未成对学生吨-测试。

**图6。**
**沉默PTPN23导致p75^NTR公司在液泡状腔室中积聚。**（A） α-p75的共焦图像^NTR公司打乱和PTPN23 shRNA处理的N2A-FLAG-TrkB细胞中的积累分析(n个=3）。用抗p75抗体培养细胞30分钟^NTR公司抗体并用100 ng/ml BDNF追踪30分钟。酸洗和固定后，使用Alexa Fluor 555偶联的二级抗体揭示受体定位。箭头表示内吞室扩大。图像显示最大强度Z轴-叠加投影，以0.5μm的间距采集。比例尺：10μm；嵌入：5μm。（B） 100个内体的直径（每个n个/条件）在三个独立实验中使用0.5μm binning进行测量和分组。内切体分为内切体（<1.5μm）或液泡（>1.5μm的）*****P（P）*<0.0001, χ²趋势的（双尾chi-square）检验(n个=3). （C）含有内溶酶体或液泡样隔室的细胞的定量(n个=3); 缺乏α-p75的细胞^NTR公司计数累积（约50%的细胞），但不包括在分析中****P（P）*<0.001，未成对学生吨-测试。（D）透射电子显微镜图像显示了三类具有代表性的含有累积α-p75的细胞器^NTR公司-金色（箭头）。打乱细胞和PTPN23-KD细胞的早期和晚期内吞室无法区分，分别从PTPN23-GD和打乱细胞上拍摄的代表性图像；仅在PTPN23-KD细胞中观察到空泡。比例尺：500 nm；插图：100纳米。

**图7。**
**含α-p75的真空室^NTR公司是对富含泛素化蛋白质的内体进行分类。**α-p75的共焦图像^NTR公司扰乱和PTPN23 shRNA-处理的N2A-FLAG-TrkB细胞中的积累。酸洗和固定后，使用抗EEA1（A）、抗Rab7（B）和抗泛素（C）抗体对细胞进行免疫染色(n个=3). 箭头表示这些蛋白质在扩大的内吞室中共同定位。（A、B、C）显示最大强度Z叠加投影的合并图像，以0.5μm的间距采集。（A′，B′，C′）插图分别显示了从A、B、C中相应的Z堆栈中选择的代表性帧。比例尺：10μm；插图：5μm。

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