Dnmt3a-Mediated DNA Methylation Changes Regulate Osteogenic Differentiation of hMSCs Cultivated in the 3D Scaffolds under Oxidative Stress

doi:10.1155/2019/4824209

.2019年11月15:2019:4824209。

doi:10.1155/2019/4824209。 2019年eCollection。

Dnmt3a介导的DNA甲基化变化调节三维支架中培养的hMSCs在氧化应激下的成骨分化

李良平^#^1 2 三, 林泽民^#¹, 文武洞⁴, 陈晓英⁵, 科琳娜·瓦特², 廖红星⁶, 奇华奇¹, 郝虎¹, 闫晨¹, 迈克尔·格林斯基², 迈克·斯蒂勒², 邹雪农¹

附属公司

¹广东省骨科与创伤重点实验室，中山大学第一附属医院骨科研究所/脊柱外科，广州510080，中国。
²德国德累斯顿德累斯顿科技大学卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯大学医院医学院和大学骨科和创伤外科中心，平移骨、关节和软组织研究中心，邮编：01307。
^三浙江大学医学院邵逸夫爵士医院骨科，浙江杭州310016。
⁴暨南大学第二临床医学院深圳人民医院骨科，深圳518020，中国。
⁵浙江大学医学院附属第二医院急诊科，杭州310009。
⁶梅州市人民医院骨科，梅州514000，中国。

^#贡献均等。

PMID： 31827676
预防性维修识别码：第6885223页
内政部： 10.1155/2019/4824209

Dnmt3a介导的DNA甲基化变化调节三维支架中培养的hMSCs在氧化应激下的成骨分化

李良平等。氧化介质细胞Longev. 2019.

.2019年11月15:2019:4824209。

doi:10.1155/2019/4824209。 2019年eCollection。

作者

李良平^#^1 2 三, 林泽民^#¹, 文武洞⁴, 陈晓英⁵, 科琳娜·瓦特², 廖红星⁶, 奇华奇¹, 郝虎¹, 闫晨¹, 迈克尔·格林斯基², 迈克·斯蒂勒², 邹雪农¹

附属公司

¹广东省骨科与创伤重点实验室，中山大学第一附属医院骨科研究所/脊柱外科，广州510080，中国。
²德国德累斯顿德累斯顿科技大学卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯大学医院医学院和大学骨科和创伤外科中心，平移骨、关节和软组织研究中心，邮编：01307。
^三浙江大学医学院邵逸夫爵士医院骨科，浙江杭州310016。
⁴暨南大学第二临床医学院深圳人民医院骨科，深圳518020，中国。
⁵浙江大学医学院附属第二医院急诊科，杭州310009。
⁶梅州市人民医院骨科，梅州514000，中国。

^#贡献均等。

PMID： 31827676
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内政部： 10.1155/2019/4824209

摘要

骨修复材料植入后会发生多种因素引起的氧化应激。DNA甲基化在成骨分化的调控中起着重要作用。此外，最近的研究表明，DNA甲基转移酶（Dnmts）参与骨形成和骨吸收。然而，OS诱导的DNA甲基化改变对植入后骨形成的影响和机制尚不清楚。与传统单层细胞培养系统相比，三维细胞培养系统在模拟体内微环境。我们开发了由矿化I型胶原组成的多孔3D支架，该支架模拟了人类骨骼细胞外基质的组成。在这里，我们首先建立了人类间充质干细胞（hMSCs）的三维培养模型，将其接种在仿生支架中，使用160μ月H₂O（运行）₂模拟植入后成骨的微环境。我们的结果表明，H诱导ALP和RUNX2甲基化水平降低₂O（运行）₂三维支架中培养的人骨髓间充质干细胞的处理。此外，我们发现Dnmt3a在猪腰椎前路椎体间融合模型中显著下调，并被H₂O（运行）₂使用3D进行治疗在体外模型。H诱导ALP和RUNX2的低甲基化₂O（运行）₂Dnmt3a过度表达导致治疗无效。此外，我们的研究结果表明，Dnmt抑制剂5-AZA可以增强OS条件下hMSCs的成骨分化，表现为ALP和RUNX2的表达增加，伴随着ALP和RUNX2 DNA甲基化的降低。综上所述，这些结果表明，Dnmt3a介导的DNA甲基化改变调节成骨分化，5-AZA可以通过OS下ALP和RUNX2的低甲基化增强成骨分化。结合5-AZA和抗氧化剂的仿生三维支架可能是一种有希望的改善植入后骨形成的新策略。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，本论文的出版不存在利益冲突。任何与本手稿主题直接或间接相关的商业方均未或将不会获得任何形式的利益。

数字

图1
在操作系统下建立3D细胞培养模型。（a）不同细胞接种方法对三维支架中hMSCs细胞分布的影响。根据培养方法的类型，将其分为四组：pbs+大、pbs+小、dmem+大和dmem+小。即“大”和“小”指500μL和50μ等细胞数的L细胞悬液（2.5×10⁵)分别添加到3D脚手架。细胞接种在三维支架中并培养24小时后，对整个支架进行MTT染色。（b） hMSCs与40、80、160、320、640和1280孵育后，使用LDH测定细胞活力μ月H₂O（运行）₂持续24小时μM小时₂O（运行）₂作为对照组。^∗*P（P）*与对照组相比<0.05。结果表明，三次试验的平均值±SD。

图2
OS条件下种植于3D支架中的人骨髓间充质干细胞的细胞内活性氧水平和成骨分化。（a） hMSCs暴露于80、160、320和640后1 h和24 h的细胞内ROS水平测定μ月H₂O（运行）₂.使用荧光微孔板阅读器测定ROS的荧光强度。0 μ月H₂O（运行）₂分别于1h和24h作为对照组。^∗*P（P）*<0.05和^***P（P）*1h时与对照组相比<0.01。^#*P（P）*<0.05和^##*P（P）*24小时（b、c、d和e）时与对照组相比<0.01。用含有80、160、320和640的基础培养基（BM）或成骨培养基（OM）培养细胞μ月H₂O（运行）₂hMSCs植入三维支架后7天。随后，进行qRT-PCR以评估ALP、RUNX2、BSP和OPN（几个关键成骨标志物）的表达。（F）在hMSCs与含有80、160、320和640的BM或OM孵育后测量ALP活性μ月H₂O（运行）₂在3D脚手架上放置14天。^∗*P（P）*<0.05和^***P（P）*< 0.01. 结果表明，三次试验的平均值±SD。

图3
OS下ALP和RUNX2的甲基化以及Dnmts的mRNA表达降低。（a，b）用含有160μM小时₂O（运行）₂在3D支架中持续7天。（c、d、e、f、g和h）在hMSCs连续暴露于160个细胞后，用qRT-PCR测定24 h和7 d时Dnmt3a、Dnmt3 b和Dnmt1的mRNA表达水平μ月H₂O（运行）₂在3D脚手架上。0 μ月H₂O（运行）₂作为对照组。^∗*P（P）*<0.05和^***P（P）*< 0.01. 结果表明，三次试验的平均值±SD。

图4
OS条件下Dnmt3a蛋白表达的下调。接种在24孔板（a）或3D支架（b）中的hMSCs与160μ月H₂O（运行）₂持续24小时μ月H₂O（运行）₂作为对照组。所示图像代表了三个独立的实验。

图5
操作系统下Dnmt3a蛋白表达和Dnmt3a拯救。（a）将接种在3D支架中的hMSCs与160μ月H₂O（运行）₂持续24小时。商业化构建重组质粒pcDNA3.1-Dnmt3a，并使用脂质体3000将其转移到hMSCs中。（b） qRT-PCR显示转染pcDNA3.1-Dnmt3a或pcDNA3.11-NC后3天OS下Dnmt3amRNA水平。（c，d）将接种在3D支架中的hMSCs与含有160μ月H₂O（运行）₂转染后3天。使用亚硫酸氢盐测序法测量ALP和RUNX2启动子区域的甲基化百分比。0 μ月H₂O（运行）₂以pcDNA3.1-NC为阴性对照。^∗*P（P）*<0.05和^***P（P）*< 0.01. 结果表明，三次试验的平均值±SD。

图6
在OS条件下，AZA通过ALP和RUNX2的低甲基化增强成骨分化。用10μM 5-AZA在3D支架中接种后24小时。然后，将细胞与含有160μ月H₂O（运行）₂在指定的时间内。（a、b、c、d）用qRT-PCR评估第7天ALP、RUNX2、BSP和OPN的mRNA表达。（e）在第14天测定ALP活性。（f，g）使用亚硫酸氢盐测序法测量7天时ALP和RUNX2启动子区域的甲基化百分比。0 μ月H₂O（运行）₂作为对照组。^∗*P（P）*< 0.05. ns：不显著。结果表明，三次试验的平均值±SD。

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1. Nakashima K.、Zhou X.、Kunkel G.等。新型含锌指转录因子Osterix是成骨细胞分化和骨形成所必需的。单元格。2002;108:17–29. doi:10.1016/s0092-8674（01）00622-5。-内政部-公共医学
1. Ozmen I.，Naziroglu M.，Okutan R.兔植入物周围组织中抗氧化酶的比较研究。细胞生物化学与功能。2006;24:275–281. doi:10.1002/cbf.1225。-内政部-公共医学
1. Lee J.，Cho Y.S.，Jung H.，Choi I.干细胞氧化应激的药理学调节。氧化药物与细胞寿命。2018年；2018:13. doi:10.1155/2018/4081890.4081890-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Tothova Z.、Kollipara R.、Huntly B.J.等。FoxO是造血干细胞抵抗生理氧化应激的关键介质。单元格。2007;128:325–339. doi:10.1016/j.cell.2007.01.003。-内政部-公共医学
1. Cabello-Verrugio C.、Vilos C.、Rodrigues-Diez R.、Estrada L.《疾病和衰老中的氧化应激：机制和治疗》，2018年。氧化药物与细胞寿命。2018年；2018:2. doi:10.1155/2018/2835189.2835189-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Nakashima K.、Zhou X.、Kunkel G.等。新型含锌指转录因子Osterix是成骨细胞分化和骨形成所必需的。单元格。2002;108:17–29. doi:10.1016/s0092-8674（01）00622-5。-内政部-公共医学

[2] Nakashima K.、Zhou X.、Kunkel G.等。新型含锌指转录因子Osterix是成骨细胞分化和骨形成所必需的。单元格。2002;108:17–29. doi:10.1016/s0092-8674（01）00622-5。-内政部-公共医学

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[4] Ozmen I.，Naziroglu M.，Okutan R.兔植入物周围组织中抗氧化酶的比较研究。细胞生物化学与功能。2006;24:275–281. doi:10.1002/cbf.1225。-内政部-公共医学

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[6] Lee J.，Cho Y.S.，Jung H.，Choi I.干细胞氧化应激的药理学调节。氧化药物与细胞寿命。2018年；2018:13. doi:10.1155/2018/4081890.4081890-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Tothova Z.、Kollipara R.、Huntly B.J.等。FoxO是造血干细胞抵抗生理氧化应激的关键介质。单元格。2007;128:325–339. doi:10.1016/j.cell.2007.01.003。-内政部-公共医学

[8] Tothova Z.、Kollipara R.、Huntly B.J.等。FoxO是造血干细胞抵抗生理氧化应激的关键介质。单元格。2007;128:325–339. doi:10.1016/j.cell.2007.01.003。-内政部-公共医学

[9] Cabello-Verrugio C.、Vilos C.、Rodrigues-Diez R.、Estrada L.《疾病和衰老中的氧化应激：机制和治疗》，2018年。氧化药物与细胞寿命。2018年；2018:2. doi:10.1155/2018/2835189.2835189-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Cabello-Verrugio C.、Vilos C.、Rodrigues-Diez R.、Estrada L.《疾病和衰老中的氧化应激：机制和治疗》，2018年。氧化药物与细胞寿命。2018年；2018:2. doi:10.1155/2018/2835189.2835189-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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