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.2019年10月3日；179（2）:470-484e21。
doi:10.1016/j.cell.2019.08.037。 Epub 2019年9月19日。

通过固有相分离和调节相分离来组织染色质

布莱恩·吉布森 1, 琳达·K·杜立德 1, 马克西米利安·W·G·施耐德 2, Liv E Jensen女士 三, 内森·加马拉 三, 丽莎·亨利 1, 丹尼尔·W·格里希 2, 赛义·雷丁 三, 迈克尔·K·罗森 4
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通过固有相分离和调节相分离来组织染色质

布莱恩·吉布森等。 单元格. .

摘要

真核染色质高度浓缩，但可动态调节并组织成亚结构域。我们证明，重组染色质在生理盐中经历组蛋白尾驱动的液-液相分离（LLPS），当微注射到细胞核中时，产生致密的动态液滴。真核生物共享的连接蛋白组蛋白H1和核小体间连接蛋白长度促进染色质的相分离，调节液滴属性，并以与细胞内染色质行为平行的方式协调形成密度一致的凝聚物。p300的组蛋白乙酰化拮抗染色质相分离，在体外溶解液滴，减少细胞核中液滴的形成。在多溴主蛋白（如BRD4）的存在下，高度乙酰化的染色质与具有不同物理性质的液滴形成一种新的相分离状态，它可以与未修饰的染色质液滴不混溶，模拟核染色质亚结构域。我们的数据提出了一个基于染色质聚合物内在相分离的框架，用于理解真核生物基因组的组织和调控。

关键词：BRD4；乙酰化；染色质组织；表观遗传学；基因组；组蛋白；组蛋白H1；核小体；核小体间距；相分离。

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M.K.R.是Third Rock Ventures的顾问。

数字

图1。
图1.生理盐中重组染色质的相分离。
（A） 用荧光团（品红色）标记的十二聚核糖体阵列（染色质，除非另有说明）的组装。（B） 添加阳离子盐后，组蛋白H2A上用Atto565（品红色）标记的染色质和用YOYO-1（绿色）染色的dsDNA的荧光显微镜图像。（C） 不同条件下染色质相图（46碱基对核小体间连接体长度）。洋红色圆圈表示LLPS。每个圆圈中的灰度表示在滴定醋酸钾（KOAc）和镁（OAc）后根据代表性图像计算的变异系数（CV）值2（顶部）或染色质（底部）。（D） Alexa Fluor 594（AF594）标记的染色质的荧光显微镜图像，具有相同核小体总浓度（100 nM）下不同数量的核小体。（E）(左边)分别具有和不具有N末端组蛋白尾部的“完整”和“无尾”核小体核心颗粒（PDBID:1AOI）的结构。(正确的)胰蛋白酶消化30分钟后AF594标记染色质的荧光显微镜图像。橙色和白色的比例尺分别为4和10μm。
图2。
图2染色质液滴高度浓缩且呈液体状。
（A） 核小体浓度在染色质滴内的图示，染色质滴由46个碱基对的核小体间连接物长度形成。详见图S3E–G。（B） AF594标记染色质液滴部分光漂白后荧光恢复的显微图像。（C） 平均相对荧光强度及其内部初始变化率的量化（黑色，k个在里面)和外部（灰色，k个外面的)穿过6个单独染色质液滴的光漂白区域。误差条和±误差是标准偏差。（D） 双色液滴混合分析的实验工作流程。（E） 用Alexa Fluor 488（AF488）或AF594融合标记的染色质滴的荧光显微镜图像。橙色和白色的比例尺分别为4和10μm。
图3。
图3组蛋白H1的C末端结构域促进染色质的相分离，改变了材料属性。
（A） 考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶，在含有牛连接蛋白组蛋白的染色质滴沉淀后，在上清液（sup.）或颗粒中形成蛋白质。（B） AF594标记染色质的荧光显微镜，在用（底部）或不使用（顶部）牛连接蛋白组蛋白的醋酸钾滴定后进行。像素强度的计数显示在每个缓冲条件的下方，橙色箭头表示暂停的熔滴融合中间产物。（C） AF594标记染色质在部分液滴光漂白后在牛连接蛋白组蛋白存在下荧光恢复的显微图像。（D） 描述LANA肽（teal）和组蛋白H1（蓝色）相对于核小体核心颗粒（PDBID:1AOI）的近似核小体结合位点的示意图。（E） 部分液滴光漂白前后人类组蛋白H1.4、LANA肽和H1.4片段与AF594标记的染色质液滴结合的GFP融合蛋白的显微图像。对于每个实验条件，分别处理图像。因此，与面板G的数据不同，相对亮度在不同条件下是不可比较的。（F） 部分液滴光漂白后GFP融合蛋白（上图）和AF594标记H2B（下图）的相对荧光恢复定量。（G） 量化染色质液滴的相对荧光强度，单独存在牛连接蛋白组蛋白或未标记的重组人组蛋白H1.4、LANA肽或H1.4碎片。误差条表示标准偏差（每种情况下N=6个液滴）。比例尺为10米。
图4。
图4核小体的生理间距驱动染色质的LLPS并调节染色质液滴密度。
（A） 以碱基对分辨率对酵母（黑色）和小鼠ES细胞（灰色）中的核小体间连接子长度进行全基因组分析。（B） LOESS归一化后（A）中的数据，以量化链接器长度偏差的程度。（C） 具有10n+5或10n碱基对距离的理想化B型DNA的末端取向轨迹（末端磷酸盐的5'至3'）。（D） 添加150 mM KOAc后，AF594标记的染色质（0.5μM核小体）的荧光显微镜图像，具有指示的核小体间连接长度（10n+5系列以上，10n系列以下）。（E） 小鼠和酵母之间核小体间连接蛋白长度和连接蛋白组蛋白表达差异的图示。（F） 由10n+5间隔的染色质组成的液滴（n=6）内的荧光强度，该染色质具有不同的核小体间连接体长度，无论是否与牛连接体组蛋白H1结合。用于分析的核小体长度假定为147 bp，标尺为10μm。
图5。
图5组蛋白乙酰化溶解染色质滴。
（A） A类子序列-含有染色质和小分子调节的模型反式激活蛋白GFP-ETR-p300帽子（B）AF594标记的染色质（洋红）和GFP融合到模型转录因子TetR（GFP-TetR）或融合到p300催化域的TetR的荧光显微镜图像帽子)（均为绿色），包括多西环素（Dox）和/或乙酰辅酶A。（C）(顶部）将多西环素和/或乙酰辅酶A加入组蛋白H3K27乙酰化的蛋白质印迹子序列-在GFP-TetR-p300存在下，含有由野生型或碱性斑突变体组蛋白组成的染色质帽子和150 mM KOAC。(底部)考马斯亮蓝染色的核心组蛋白SDS-PAGE凝胶。（D） AF594标记染色质（洋红）和GFPTetR-p300的荧光显微镜帽子（绿色）添加乙酰辅酶A后。（E） GFP-TetR-p300存在下AF594标记染色质液滴的平均液滴圆度和像素强度帽子添加乙酰辅酶A后。误差条表示标准误差。橙色和白色的比例尺分别为4和10μm。
图6。
图6：细胞核阵列在细胞核中形成浓缩物。
（A） 将荧光标记的核糖体阵列核微注射到培养细胞中。（B）(左边)Hoechst 33342 DNA染色HeLa细胞核共聚焦活细胞荧光显微镜(中间的)未修饰核糖体阵列（绿色）和乙酰化核糖体数组（品红色）。(正确的)共焦荧光显微镜图像橙色虚线框中DNA、未修饰阵列和乙酰化核小体阵列的特写视图。（C） Hoechst 33342 DNA染色和未修饰AF488标记阵列或乙酰化AF594标记阵列之间两个生物复制品中31个细胞的平均荧光强度的空间相关性。（D） 用曲古菌素A治疗3小时后，将未修饰的核小体阵列和乙酰化的核小体阵列注射到Hoechst 33342染色的HeLa细胞核中的共焦活细胞荧光显微镜。两个生物复制品中42个细胞的定量（平均荧光>0.5 AU）（E）核内注射未修饰和乙酰化核小体阵列的平均核荧光和变异系数（CV）（F）。
图7。
图7.BRD4促进乙酰化染色质的新液相。
（A） BRD4和bromo的域组织示意图5以及它们与乙酰赖氨酸的JQ-1敏感性相互作用。（B） 和（C）AF594标记的染色质（品红色）在p300催化域未乙酰化和乙酰化的荧光显微镜图像帽子和（B）含有合成GFP标记的溴代多巴胺蛋白，（C）含有BRD4，无JQ-1和JQ-1。（D） BRD4对非乙酰化和乙酰化染色质的影响示意图。（E） 单独由染色质和BRD4或溴组成的染色质液滴的相对H2B荧光强度5和乙酰化染色质。（F） 荧光显微镜观察未经修饰的AF594标记染色质与化学计量数量的未经修饰或乙酰化的AF488标记染色质混合后的荧光显微镜5比例尺为10μm。（G） 基于相分离的细胞核染色质组织模型。
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