Microparticles from tumors exposed to radiation promote immune evasion in part by PD-L1

doi:10.1038/s41388-019-0971-7

.2020年1月；39(1):187-203.

doi:10.1038/s41388-019-0971-7。 Epub 2019年8月29日。

PD-L1在一定程度上促进了肿瘤辐射微粒的免疫逃逸

附属公司

¹以色列海法Technion Rappaport医学院细胞生物学与癌症科学。
²以色列海法拉姆巴姆健康护理校区肿瘤研究所放射肿瘤科。
^三格罗宁根大学肿瘤医学系，荷兰格罗宁恩大学医学中心。
⁴美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院国家癌症研究所综合肿瘤流行病学分所癌症流行病学与遗传学部。
⁵桑尼布鲁克健康科学中心，加拿大安大略省多伦多市。
⁶以色列海法Technion Rappaport医学院细胞生物学与癌症科学。yshaked@tx.technion.ac.il。

^#贡献均等。

PMID： 31467431
预防性维修识别码： PMC6937213型
内政部： 10.1038/s41388-019-0971-7

PD-L1在一定程度上促进了肿瘤辐射微粒的免疫逃逸

迈克尔·蒂马纳等。癌基因. 2020年1月.

.2020年1月；39(1):187-203.

doi:10.1038/s41388-019-0971-7。 Epub 2019年8月29日。

附属公司

¹以色列海法Technion Rappaport医学院细胞生物学与癌症科学。
²以色列海法拉姆巴姆健康护理校区肿瘤研究所放射肿瘤科。
^三格罗宁根大学肿瘤医学系，荷兰格罗宁恩大学医学中心。
⁴美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院国家癌症研究所综合肿瘤流行病学分所癌症流行病学与遗传学部。
⁵桑尼布鲁克健康科学中心，加拿大安大略省多伦多市。
⁶以色列海法Technion Rappaport医学院细胞生物学与癌症科学。yshaked@tx.technion.ac.il。

^#贡献均等。

PMID： 31467431
预防性维修识别码： PMC6937213型
内政部： 10.1038/s41388-019-0971-7

摘要

放射治疗通过多种机制诱导癌症患者的免疫相关反应。在这里，我们研究肿瘤衍生微粒（TMPs）的免疫调节作用，即放射治疗后从肿瘤细胞脱落的细胞外囊泡。我们证明，乳腺癌细胞暴露于含有高水平免疫调节蛋白的辐射棚TMP中，其中之一是程序性死亡1（PD-L1）。这些TMP在体内外均能抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性，从而促进肿瘤生长。显然，与对照小鼠相比，过继转移预先培养有TMP的CTL（来自未经处理的肿瘤细胞）可提高小鼠受体的肿瘤生长率。此外，通过基因或药物阻断PD-1-PD-L1轴，部分缓解了TMP介导的CTL活性抑制，表明TMP对放射治疗的免疫调节作用部分由PD-L1介导。总的来说，我们的发现提供了对放射治疗后肿瘤免疫监测状态的机制性见解，并表明放射治疗和免疫检查点抑制剂之间的治疗协同作用。

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图1
辐射细胞的TMP含有不同的免疫调节蛋白。一TMP收集自未经处理（对照）或2 Gy辐照（RT）EMT/6或PyMT细胞。蛋白质含量通过质谱分析进行表征。主成分分析表明对照样品和辐照样品之间存在明显的分离。b条,**c（c）**对比对照组和辐照EMT/6的TMP的热图（左）和火山图（右）(b条)或PyMT(**c（c）**)单元格。d日EMT/6、PyMT、4T1、E0771和DA3乳腺癌细胞培养物以指示的辐射剂量照射一次。48小时后，通过流式细胞术评估PD-L1表达细胞和PD-L1阳性TMP的百分比(n个 = 3个生物重复）***对 < 0.001（对于细胞）和^#对 < 0.05;^##对 < 0.01;^###对 < 0.001（TMP），由双尾学生评估吨测试（针对b条,**c（c）**)或单向方差分析，然后进行Tukey事后检验（针对d日)

图2
辐照EMT/6和PyMT细胞产生的TMP抑制细胞毒性T细胞活性。一从8–10周龄BALB/c幼鼠分离的脾细胞与CD3培养⁺/CD28编号⁺如图所示，在没有（基线）或存在TMP的情况下，T细胞激活珠源自对照或辐照的WT EMT/6或PyMT细胞或其PD-L1 KO对应物。阴性对照（NC）是指没有活化珠的培养物。20小时后，收集脾细胞和活化的细胞毒性T细胞（CD8）的百分比⁺/CD25型⁺)流式细胞仪检测。b条所述培养物条件培养基中的颗粒酶B水平(一)用特异性ELISA检测。结果代表三个生物重复。**c（c）**,d日8至10周龄SCID和6 Gy亚致死剂量照射C57Bl/6小鼠(n个 = 将EMT/6或PyMT细胞以1:100的比例与未经治疗（幼年）小鼠的脾细胞混合，植入5只小鼠/组）。此外，在一些组中，这些样品与来自对照或2Gy辐照细胞的TMP混合，然后注射到小鼠体内。EMT/6或PyMT细胞与来自荷瘤小鼠的活化脾细胞的混合物用作阳性对照。将EMT/6和PyMT单独植入乳腺脂肪垫作为阴性对照。每周评估两次肿瘤生长(**c（c）**). 在实验结束时，提取肿瘤，并计算肿瘤细胞总数和活化CD8细胞（CD8）的百分比⁺/CD25型⁺)通过流式细胞术进行评估(d日). *对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.001，通过单向方差分析和Tukey事后检验进行评估

图3
来自辐照EMT/6或PyMT细胞的TMP在体内促进肿瘤生长并抑制细胞毒性T细胞活性。一EMT/6或PyMT肿瘤细胞（5×10⁵/小鼠）分别原位植入8–10周龄雌性BALB/c和C57Bl/6小鼠的乳腺脂肪垫(n个 = 4-5只小鼠/组）。当肿瘤达到~100mm时^三，小鼠每3天静脉注射一次PBS（对照组）或来自对照组的TMP，或2 Gy照射的EMT/6或PyMT细胞（用箭头表示，1×10⁵TMP/鼠标）。每周监测两次肿瘤体积。b条–d日在实验结束时，抽血并采集肿瘤和脾脏。活化CD8细胞（CD8⁺/CD25型⁺)在肿瘤中进行评估(b条)、脾脏(**c（c）**)和外周血(d日)流式细胞术检测*对 < 0.05, **对 < 0.01，通过单向方差分析和Tukey事后检验进行评估

图4
辐射乳腺癌细胞产生的TMP积聚在脾脏和肝脏中。一用PKH26标记未经处理（对照）或2Gy辐照的EMT/6细胞释放的TMP，PKH26是一种膜荧光连接物。荧光标记TMP（1×10⁵TMP/小鼠）静脉注射至8–10周龄BALB/c小鼠(n个 = 3-4只小鼠/组）。对照小鼠注射PBS。24小时后，将指示器官均质化，PKH26的百分比⁺通过流式细胞术评估上清液中总微粒（MP）中的细胞（可能与TMP融合的细胞）和PKH26标记的TMP。b条所示为注射PBS（对照）的小鼠脾脏、肝脏、肾脏和腋窝淋巴结中总MP的PKH26标记TMP的代表性流式细胞仪斑点图，或未经处理（对照）或辐照细胞的TMP。**c（c）**小鼠脾脏、肝脏、肾脏和腋窝淋巴结的切片(一)用辐照EMT/6细胞的TMP注射后，用DAPI染色并用荧光显微镜进行分析。显示了具有代表性的图像。放大倍数×1000视野；比例尺=20µm*对 < 0.05（针对脾脏），^$对 < 0.05和^$$对 < 0.01（对于肝脏），通过单向方差分析和Tukey事后检验进行评估

图5
预先将细胞毒性T细胞暴露于来自辐照细胞的TMP可抵消T细胞介导的肿瘤生长抑制作用。收集8-10周龄幼鼠、EMT/6或PyMT荷瘤小鼠（分别为BALB/c和C57Bl/6小鼠）的脾脏，并制备成单细胞悬浮液，CD8⁺通过阴性选择分离细胞。CD8（CD8）⁺将来自荷瘤小鼠的细胞单独培养24小时（活化CD8），或与来自对照EMT/6或PyMT细胞的TMP（活化CD8+TMP对照）或2 Gy辐照EMT/6和PyMT电池（活化CD3+TMP 2 Gy）一起培养24小时。CD8（CD8）⁺将每组的细胞静脉注射到携带EMT/6肿瘤的8-10周龄雌性SCID小鼠或携带6Gy亚致死辐照的PyMT肿瘤的C57Bl/6小鼠（10⁶细胞/鼠标，n个 = 5只小鼠/组）。对照小鼠注射PBS（未经处理）。一CD8的采纳转让⁺每周在指定的时间点（箭头）执行细胞操作，直到结束。每隔一天评估肿瘤生长情况。b条在实验结束时，取下脾脏，制备成单细胞悬液，用于评估CD8总量⁺细胞和活化T细胞（CD8⁺/CD25型⁺)流式细胞术检测*对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.001，通过单向方差分析和Tukey事后检验进行评估

图6
TMP介导的细胞毒性T细胞活性抑制部分依赖于PD-1-PD-L1轴。一–d日CD8（CD8）⁺从EMT/6或PyMT荷瘤小鼠（活化CD8）的脾脏分离细胞。CD8⁺用未经处理的TMP（激活的CD8+TMP对照）或2Gy辐照的WT或PD-L1 KO EMT/6或PyMT细胞（分别为激活的CD8+TMP 2Gy和激活的CD8-KO TMP 2gy组）培养细胞。此外，CD8⁺在存在抗PD-L1抗体（10µg/ml）（活化CD8+TMP2 Gy+αPD-L1）的情况下，用从2 Gy辐照的WT EMT/6或PyMT细胞中提取的TMP培养细胞。20小时后，CD8⁺清洗细胞，然后用于EMT/6上进行的T细胞杀伤试验(一)或PyMT(b条)细胞，作为碘化丙啶（PI）染色的功能(n个 = 5个生物重复）。单独培养的EMT/6或PyMT细胞作为阴性对照（未经处理）。显示了12小时时间点的典型显微照片(**c（c）**). 3小时时间点的T细胞杀伤试验由条形图表示(d日). *对 < 0.05, ***对 < 0.001，使用单向方差分析，然后进行Tukey事后检验

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