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。2019年8月16日；9(1):11945.
doi:10.1038/s41598-019-48421-9。

细胞塌陷和脊髓运动轴突引导中的ephrin-B:EphB信号需要内体分选适配器HD-PTP

西尔维·拉哈伊 1 2, 丹尼尔·莫拉莱斯 1 2 三, 哈利尔·巴奇 1 4, 努梅拉·哈穆德 1, 查尔斯·伊蒂安·卡斯通圭 1, 贾拉尔·M·喀山 5 6, 纪尧姆·德罗切斯 5 6, 阿维胡·克拉尔 7, 安妮·克劳德银杏 8 9, Arnim暂停 5 6, Jean-François科特迪瓦 1 4 10 11, 阿图尔·卡尼亚 12 13 14 15
附属公司

细胞塌陷和脊髓运动轴突引导中的ephrin-B:EphB信号需要内体分选适配器HD-PTP

西尔维·拉海尔等。 科学代表。 。

摘要

许多跨膜受体介导细胞间通讯的信号输出受到转运所需的内胚体分选复合体（ESCRT）的限制，但这种机制对Eph酪氨酸激酶受体功能的影响尚不清楚。我们将ESCRT相关衔接蛋白HD-PTP鉴定为EphB2依赖性生物素识别（BioID）相互作用组的一部分，并使用联合免疫沉淀法证实了这种关联。HD-PTP的丢失减弱了ephrin-B2:EphB2信号诱导的培养细胞和轴突生长锥的崩溃，并导致鸡脊髓运动神经元轴突在体内的异常导向。HD-PTP的缺失消除了ephrin-B2诱导的EphB2聚集以及EphB2和Src家族激酶的激活。HD-PTP的丢失也加速了配体诱导的EphB2降解，与HD-PTP丢失对其他细胞表面受体信号传递的影响形成对比。我们的结果将Eph功能与ESCRT机制联系起来，并证明HD-PTP在ephrin-B:EphB信号传导的早期步骤中以及在阻止受体过早耗竭中的作用。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
配体刺激的EphB2-最大蛋白的BioID筛选。(一)BioID实验示意图：将FLAG标记的生物素连接酶BirA*融合到EphB2的C末端，并在HEK293细胞中稳定表达。根据ephrin-B2配体的存在，不同的蛋白质被招募到EphB2附近并用生物素标记。(b条)表达EphB2-BirA*-FLAG的HEK293细胞的质量标准样品蛋白裂解物中生物素化的Western blot（通道2，无配体；通道3，1.5µg/mL Fc；和通道4，1.5µg/mL预先聚集的ephrin-B2-Fc）或仅FLAG（通道1）(n个 = 2). (c（c）)基因本体论与KEGG–与eB2 WD-score和Fc-WD-scores分析中确定的蛋白质相关的术语。蓝色条代表eB2处理样品中富含的蛋白质，红色条代表Fc处理样品中富集的蛋白质。(天)在Cytoscape生成的eB2或Fc WD-核心分析中确定的蛋白质的相互作用网络，并与MCluster聚类，除以基因本体术语。(e（电子）)eB2和Fc条件下已知EphB2效应器或交通相关猎物的点图。光谱计数通过填充阴影、与EGFP-BirA*-FLAG条件相比的蛋白质相对丰度（通过圆圈大小显示）来说明，外圆颜色表示与EGFP-BirA*/FLAG MS SAINT分析相比的BFDR值。全尺寸的蛋白质印迹在补充材料中。kDa：千道尔顿；eB2：肾上腺素-B2-Fc；BFDR：贝叶斯错误发现率。
图2
图2
EphB2和HD-PTP可以形成配体依赖的复合物。(一)在转染HD-PTP-HA并单独表达EphB2-BirA*-FLAG或FLAG的HEK293细胞中进行的联合免疫沉淀实验的代表性印迹。HA的吸液显示，仅在用1.5µg/mL eB2刺激15分钟的细胞中，HD-PTP和EphB2的下拉。(b条)在转染HD-PTP-HA并单独表达EphB2-BirA*-FLAG或FLAG的HEK293细胞中进行的联合免疫沉淀实验的总细胞裂解物的代表性印迹。全尺寸的蛋白质印迹在补充材料中。tr：转染；ip：免疫沉淀；kDa：千道尔顿；eB2:ephrin-B2-Fc。
图3
图3
HD-PTP是ephrin-B2诱导的细胞崩溃所必需的。(一)Alexa Fluor 568-共轭类卵磷脂染色对照的代表性图像shRNA和HD-PTPshRNA用EphB2-GFP转染HeLa细胞，并用1µg/mL eB2或Fc刺激15分钟。(b条)HeLa细胞面积的量化显示对照组shRNAEphB2-OE细胞在1µg/mL eB2的作用下收缩至约一半大小，而HD-PTPshRNAEphB2-OE细胞仅崩溃约20%(n个 = 3、60–80个电池/n个; 控制shRNA,第页 = 0.0003; HD-PTP（HD-PTP）shRNA,第页 = 0.0008; 学生的t吨-测试）。(c（c）)Alexa Fluor 568-共轭对照卵磷脂染色的代表性图像shRNA和HD-PTPshRNA用0.3µg/mL Sema3A-Fc或Fc处理HeLa细胞15分钟(天)HeLa细胞面积定量显示对照shRNAHeLa细胞在0.3µg/mL Sema3A-Fc和HD-PTP的作用下体积缩小到一半以下shRNAHeLa细胞崩解程度相同(n个 = 3、60–80个电池/n个; 控制shRNA 与HD-PTP（HD-PTP）shRNA,第页 = 0.3880; 学生的t吨-测试）。数值绘制为平均值±SD。所有数值见补充表S4。eB2：肾上腺素-B2-Fc***第页 < 0.001; *第页 < 0.05; n.s.：不重要。反转灰度荧光图像。
图4
图4
胚胎运动神经元中HD-PTP的表达和CRISPR介导的耗竭。(一)HH st.25和HH st.28鸡胚脊髓切片的代表性图像，其中ISL1型和PTPN23型（鸡HD-PTP-encoding基因）mRNA检测采用就地杂交。注释表达式PTPN23型在里面ISL1型-表示运动柱（箭头）。(b条)对照组电穿孔胚胎脊髓分离运动神经元的生长锥和细胞体中抗HD-PTP抗体染色的代表性图像CRISPR公司或HD-PTPCRISPR公司质粒。(c（c）)从胚胎脊髓采集的分离运动神经元生长锥中HD-PTP信号的量化显示HD-PTP的信号减少CRISPR公司与对照组相比CRISPR公司(n个 = 3、10–12个生长锥/n个;第页 = 0.0023; 学生的t吨-测试）。(天)胚胎脊髓分离运动神经元胞体中HD-PTP信号的定量显示HD-PTP的信号减少CRISPR公司与对照组相比CRISPR公司(n个 = 3、30–50个细胞体/n个;第页 = 0.0009; 学生的t吨-测试）。数值绘制为平均值±SD。所有数值见补充表S4***第页 < 0.001; **第页 < 0.01. 可见光图像(一)和倒灰度荧光图像(b条).
图5
图5
脊髓运动轴突生长锥需要HD-PTP来应对肾上腺素B2诱导的塌陷。(一)GFP的代表性图像+游离对照的生长锥CRISPR公司-或HD-PTPCRISPR公司-电穿孔运动神经元，与eB2、Sema3F或Fc孵育，并用抗GFP抗体染色。(b条)使用与Control电穿孔的分离运动神经元进行的救援实验中生长锥的代表性图像CRISPR公司质粒或HD-PTPCRISPR公司与hHD-PTP或hHD-PTPC/S质粒共同电穿孔，用10µg/mL eB2或Fc孵育30分钟，并用抗HD-PTP抗体染色。(c（c）)用CRISPR构建体电穿孔并用配体刺激的解离运动神经元中塌陷生长锥的定量。HD-PTP（HD-PTP）CRISPR公司或控制CRISPR公司用10µg/mL eB2或Fc培养生长锥30分钟。HD-PTP的崩溃响应CRISPR公司与对照组相比，eB2的生长锥显著减弱CRISPR公司(n个 = 3、90个生长锥/n个;第页 < 0.0001; 费希尔精确测试）。用Control电穿孔的分离运动神经元的生长锥进行救援实验CRISPR公司，或HD-PTPCRISPR公司与hHD-PTP或hHD-PTPC/S表达质粒共同电穿孔，用10µg/mL eB2或Fc孵育30分钟，并用抗HD-PTP和抗Isl1抗体染色。两组人群对eB2治疗的反应与对照组无明显区别(n个 = 4，50个生长锥/n个; 费希尔精确测试）。HD-PTP（HD-PTP）CRISPR公司或控制CRISPR公司将生长锥与0.3µg/mL Sema3F-Fc或Fc一起孵育30分钟。两个CRISPR生长锥种群表现相同，表明HD-PTP缺失不会影响对Sema3F的反应(n个 = 4，30个生长锥/n个; 费希尔精确测试）。数值绘制为平均值±SD。所有数值见补充表S4。h： 人；S3F:Sema3F；eB2：肾上腺素-B2-Fc***第页 < 0.001; 注：不重要。反转灰度荧光图像。
图6
图6
HD-PTP是ephrin-B2诱导的SFK激活、EphB2磷酸化和EphB2-表面修补所必需的。(一)Control的代表图像CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司脊髓运动神经元生长锥，用10µg/mL eB2或Fc孵育15分钟，并用抗磷-Y418-SFK染色，显示eB2暴露后SFK激活。(b条)对照组中抗磷酸化Y418-SFK信号的量化CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司运动神经元生长锥，用10µg/mL eB2或Fc孵育15分钟。控制CRISPR公司生长锥显示配体诱导的SFK活化增加(第页 < 0.0001），但HD-PTPCRISPR公司生长锥没有(第页 = 0.9810) (n个 = 3、10–12个生长锥/n个; 单因素方差分析，然后修正学生的t吨-测试）。(c（c）)对照组EphB2（含抗FLAG抗体）下拉后使用抗磷酸酪氨酸和抗FLAG的代表性Western blotshRNA和HD-PTPshRNA用1µg/mL eB2或Fc刺激HeLa细胞5分钟。谱带大小与EphB2相对应。(天)FLAG信号上磷酸化酪氨酸信号的定量显示配体诱导的对照组EphB2磷酸化shRNAHeLa细胞(第页 = 0.0284），但在HD-PTP中没有shRNA单元格(第页 = 0.3908) (n个 = 三；单因素方差分析，然后是Student’st吨-测试）。(e（电子）)对照组的代表性图像CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司脊髓运动神经元生长锥，用未聚集的10µg/mL eB2或Fc孵育2分钟，并用抗Fc抗体染色，显示eB2暴露后抗Fc染色增强。(（f）)控制中抗Fc信号的量化CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司运动神经元生长锥，与10µg/mL未聚集的eB2或Fc孵育2分钟。控制CRISPR公司生长锥显示配体诱导的抗Fc信号增加(第页 = 0.0011）和HD-PTPCRISPR公司eB2刺激后，生长锥也表现出增加(第页 = 0.0028) (n个 = 3、10–12个生长锥/n个; 单因素方差分析，然后修正学生的t吨-测试）。(克)Control的代表图像CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司运动神经元生长锥，与10µg/mL eB2或Fc孵育15分钟，并使用非渗透固定条件对EphB2进行免疫染色。通过增加表面抗EphB2染色的信号强度，可以观察到EphB2-修补。(小时)控制中EphB2修补的量化CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司运动神经元生长锥，用10µg/mL eB2或Fc孵育15分钟，用含有表面EphB2信号的生长锥面积百分比测量。与Control相比CRISPR公司生长锥(第页 = 0.017），HD-PTPCRISPR公司生长锥未能在配体结合时引发EphB2表面修补(第页 = 0.5707) (n个 = 三；单因素方差分析，然后修正学生的t吨-测试）。数值绘制为平均值±SD。所有数值见补充表S4。全尺寸的蛋白质印迹在补充材料中。tr:转染；ip：免疫沉淀；kDa：千道尔顿；eB2：肾上腺素-B2-Fc；perm：渗透***第页 < 0.001; **第页 < 0.01*第页 < 0.05; 注：不重要。反转灰度荧光图像。
图7
图7
HD-PTP损失增加了EphB2溶酶体降解的速率。(一)Control的代表图像CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司脊髓运动神经元生长锥，用10µg/mL eB2或Fc孵育20分钟，用抗EphB2抗体染色，然后进行酸剥离，以显示内化的EphB2。(b条)对照组内化EphB2的量化CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司运动神经元生长锥，用10µg/mL eB2或Fc孵育20分钟。控制CRISPR公司生长锥显示配体诱导的内化EphB2增加(第页 = 0.0023），但HD-PTPCRISPR公司生长锥没有(第页 = 0.9831) (n个 = 3、10–12个生长锥/n个; 单因素方差分析，然后修正学生的t吨-测试）。(c（c）)Control的代表图像shRNA和HD-PTPshRNAHeLa细胞，用1µg/mL eB2或Fc孵育10分钟，用抗EphB2抗体染色，然后进行酸剥离，以显示内化的EphB2。(天)对照组内化EphB2染色的定量shRNA和HD-PTPshRNA用1µg/mL eB2或Fc培养HeLa细胞10分钟。控制shRNAeB2刺激后，EphB2内吞信号增加(第页 = 0.0216），但HD-PTPshRNAHeLa细胞内吞EphB2没有明显增加(第页 = 0.9001) (n个 = 3、10–12个细胞/n个; 单因素方差分析，然后修正学生的t吨-测试）。(e（电子）)转染对照组中抗FLAG抗体检测EphB2表达的代表性Western blotshRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺孵育后的不同时间点裂解，暴露于1µg/mL eB2或Fc。β-肌动蛋白检测被用作内部控制。(（f）)转染对照组中抗FLAG抗体检测EphB2的Western blot定量shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和1µg/mL eB2或Fc孵育后裂解。FLAG信号强度归一化为β-肌动蛋白，并绘制不同时间点的曲线。与Fc相比，在环己酰亚胺处理后30分钟，eB2刺激似乎可以保护EphB2免受降解(n个 = 三；学生的t吨-测试）。(克)用转染HD-PTP的抗FLAG抗体检测EphB2的代表性Western blotshRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和1µg/mL eB2或Fc孵育后的不同时间点裂解。β-actin用作内部控制。(小时)转染HD-PTP中抗FLAG抗体检测EphB2的Western blot定量shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和1µg/mL eB2或Fc孵育后裂解。FLAG信号强度归一化为β-肌动蛋白，并绘制不同时间点的曲线。与Control相比shRNAHeLa细胞，HD-PTP中shRNA在放线菌酮处理后30分钟，HeLa细胞，eB2刺激似乎比Fc增加了EphB2降解率(n个 = 三；学生的t吨-测试）。(我)转染对照组中抗FLAG抗体检测EphB2表达的代表性Western blotshRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和溶酶体阻滞剂10 mM NH孵育后的不同时间点裂解4Cl，暴露于1µg/mL eB2或Fc。β-actin检测用作内部控制。(j个)转染对照组中抗FLAG抗体检测EphB2的Western blot定量shRNA用10µg/mL蛋白质合成阻断剂环己酰亚胺和溶酶体阻断剂10mM NH孵育后的HeLa细胞裂解物4Cl，暴露于1µg/mL eB2或Fc。FLAG信号强度归一化为β-肌动蛋白，并绘制不同时间点的曲线。在环己酰亚胺处理和溶酶体阻断后60分钟，EphB2的降解水平似乎得到了挽救(n个 = 4; 学生的t吨-测试）。(k个)用抗FLAG抗体检测转染HD-PTP中EphB2表达的代表性Western blotshRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和溶酶体阻滞剂10 mM NH孵育后的不同时间点裂解4Cl，暴露于1µg/mL eB2或Fc。β-actin检测用作内部控制。(我)在转染的HD-PTP中用抗FLAG抗体检测到的EphB2的蛋白质印迹的定量shRNAHeLa细胞在与10µg/mL蛋白质合成阻滞剂环己酰亚胺和溶酶体阻滞剂10 mM NH孵育后裂解4Cl，暴露于1µg/mL eB2或Fc。FLAG信号强度归一化为β-肌动蛋白，并绘制不同时间点的曲线。在环己酰亚胺处理和溶酶体阻断后60分钟，EphB2的降解水平似乎得到了挽救(n个 = 4; 学生的t吨-测试）。数值绘制为平均值±标准差。所有数值可在补充表S4中找到。全尺寸的蛋白质印迹在补充材料中。CHX：环己酰亚胺；eB2：肾上腺素-B2-Fc***第页 < 0.001; **第页 < 0.01; *第页 < 0.05; 注：不重要。反转灰度荧光图像。
图8
图8
ephrin-B:EphB-介导的脊髓运动轴突引导需要HD-PTP体内. (一)控制的代表部分CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司HH St.25脊髓显示Isl1、Foxp1和FLAG（Cas9表达标记）的表达，证明运动神经元的有效电穿孔。(b条)Isl1的量化+对照组内侧LMC神经元CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司胚胎。它们的数量在两个胚胎群体之间没有显著差异（n=3，10节/n；学生的t检验）。(c（c）)Foxp1的量化+控制中的LMC运动神经元CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司胚胎。它们的数量在两种条件之间没有差异（n＝3，10个节/n；学生的t检验）。(天)对照组肢体神经的代表性图像CRISPR公司和HD-PTPCRISPR公司HH St.25胚胎，用抗Tuj1抗体染色以显示肢体神经和e[Isl1]：：GFP位于LMC内侧轴突。HD-PTP中内侧轴突异常支配背侧间质CRISPR公司胚胎。(e（电子）)量化e[Isl1]：：GFP背神经与腹神经的表达。控制CRISPR公司胚胎在腹神经中含有约93%的GFP，在背神经中含有约7%的GFP。HD-PTP（HD-PTP）CRISPR公司胚胎的腹神经和背神经中分别含有约74%和26%的GFP，这表明HD-PTP的破坏体内损害内侧LMC轴突的保真度(n个 = 5个胚胎，10-20个切片/n个;第页 = 0.0149; 学生的t吨-背部对照中GFP信号%之间的测试CRISPR公司与背部HD-PTP相比CRISPR公司). 数值绘制为平均值±SD。所有数值见补充表S4。d： 背侧；v—腹侧*第页 < 0.05; 注：不重要。反转灰度荧光图像和双色图像。
图9
图9
HD-PTP在EphB信令中的双重作用模型。(一)在基础条件下，EphB2受体以不聚集分子的形式存在于细胞膜上，HD-PTP与之无关。在信号启动过程中，HD-PTP与配体激活的EphB2形成分子复合物，并促进受体多聚。HD-PTP缺失导致配体诱导的受体磷酸化减弱、Src家族激酶激活和排斥性细胞反应体外和体内. (b条)配体结合的EphB2复合物内化在早期内体中，从中受体可以再循环回到膜或分类到内吞途径以进行溶酶体降解。我们的数据表明，内化的EphB2复合物以HD-PTP依赖的方式受到溶酶体降解的保护。HD-PTP的氘化酶招募功能可能在这一过程中发挥作用。
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