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.2019年9月10日；140（11）：921-936。
doi:10.1116/循环AHA.118.034731。 Epub 2019年6月21日。

多囊藻毒素-1与Kv通道结合调控心肌细胞复极性和收缩性

弗朗西斯科·阿尔塔米拉诺 1, 加布里埃尔·G·希亚塔雷拉 1 2, Kristin M法语 1, 金秀英（Soo Young Kim） 1, 费利佩·恩格尔伯格 三, 塞尔吉·基里琴科 1, Elisa Villalobos公司 1, 丹东 1, 杰伊·施耐德 1, 塞萨尔·拉米雷斯-萨米恩托 三, 塞尔吉奥·拉万德罗 1 4 5, 托马斯·吉列 1, 约瑟夫·希尔 1 6
附属机构

多囊藻毒素-1与Kv通道结合调控心肌细胞复极性和收缩性

弗朗西斯科·阿尔塔米拉诺等人。 循环. .

摘要

背景：多囊藻毒素-1（PC1）是一种跨膜蛋白，最初在常染色体显性多囊肾病中发现，它调节钙渗透阳离子通道多囊藻素-2。常染色体显性多囊肾病患者会出现肾功能衰竭、高血压、左心室肥厚和舒张功能障碍等心血管疾病。这些人的心肌细胞中存在PC1功能丧失突变，但其功能后果尚不清楚。PC1广泛表达，其在心肌细胞特异性敲除小鼠中的实验性消融降低了收缩功能。在此，我们着手确定PC1在心肌细胞中的病理生理作用。

方法：通过超声心动图分析野生型和心肌细胞特异性PC1基因敲除小鼠。在分离的心肌细胞和人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞中评估兴奋-收缩耦合，并在异源表达系统中探索功能后果。蛋白质相互作用通过生物化学和从头计算进行分析。

结果：PC1消融降低心肌细胞动作电位持续时间，降低钙2+短暂性和心肌细胞收缩性。PC1缺陷的心肌细胞显示肌内质网Ca减少2+动作电位持续时间和肌内质网钙减少导致的储存2+ATP酶（SERCA）活性。向外K增加+电流降低了缺乏PC1的心肌细胞的动作电位持续时间。HEK293细胞中全长PC1的过度表达显著降低了异源表达的Kv4.3、Kv1.5和Kv2.1钾通道的电流密度。PC1 C末端抑制Kv4.3电流的程度与全长PC1相同。此外，与Kv4.3共免疫沉淀的PC1和模拟的PC1 C末端结构表明，在Kv4.3的N末端存在2个PC1对接位点，支持物理相互作用。最后，一个自然发生的人类突变PC1R4228X型对Kv4.3通道活性无抑制作用。

结论：我们的研究结果揭示了PC1在调节多个Kv通道、调节膜复极和SERCA活性改变（降低心肌细胞收缩性）中的作用。

关键词：Kv1.5钾通道；Kv2.1钾通道；Kv4.3钾通道；L型钙通道；动作电位；ryanodine受体；电压门控钾通道。

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数字

图1：
图1:。心肌细胞特异性PC1消融后收缩和舒张收缩功能降低。
答：。清醒小鼠（8-16周龄）的典型B型和M型超声心动图。B。收缩性能量化为缩短百分比[FS（%）]，与对照小鼠（F/F）相比，PC1 cKO（cKO）的收缩功能降低。C、。LVEdD，左心室舒张末期直径。D。LVEsD，左心室收缩末期直径。E。左心室（LV）质量。F、。麻醉小鼠的典型脉搏波和组织多普勒记录以测量舒张功能的E/A和E/E比值(G-H公司). PC1 cKO小鼠的舒张功能受损。数据来自“n”只不同的小鼠，显示在每个栏的底部**P（P）<0.01***P（P）<0.001; ns：无显著差异；与F/F.未付吨测试。一、。在从F/F和PC1 cKO（cKO）小鼠分离的成年心肌细胞以0.5 Hz起搏期间，使用IonOptix成像系统获得的代表性收缩轨迹。J-N公司。定量基线肌节长度、收缩峰值、最大速度和收缩力曲线达到峰值的时间。在成年PC1 cKO心肌细胞中观察到收缩性降低，收缩和舒张动力学变慢*P（P）<0.05; ns：无显著差异；与F/F.未付吨测试。
图2：
图2:。成年PC1 cKO心肌细胞的心肌细胞动作电位受损。
答：。ECC过程示意图。动作电位（AP）传播到心肌细胞T小管网络，促进LTCC依赖性钙2+条目。钙的流入2+触发RyR2激活（位于肌浆网SR）和随后的大量钙2+释放是为了引起收缩。B。通过全细胞电流钳获得的典型AP痕迹（细胞内溶液含有5 mM EGTA）。首席执行官。50%和90%复极时的AP持续时间（APD50和APD90)显示PC1消融后AP持续时间缩短。E。AP振幅（APA，绝对值），F、。最大上冲程斜率（dV/dt最大值)和(克)成年F/F和PC1 cKO心肌细胞的静息膜电位（Vm）H。代表性心电图显示QT间期缩短(我)在cKO小鼠中。J。通过荧光伏特和共焦显微镜评估T小管网络。比例尺=10μm。英国。T和L小管密度（T和L密度）、总体T小管规则性和T小管完整性（TT整数)使用AutoTT软件进行测量，并按所述进行表示。在PC1缺陷型心肌细胞（PC1 cKO）中，未观察到T小管网络的差异。数据是从每个基因型的至少三种不同培养物中获得的，每个栏的底部显示“n=细胞”*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ns：无显著差异；与F/F.未付吨测试。
图3：
图3:。钙2+PC1缺陷的成年心肌细胞的循环减少。
答：。以1 Hz的频率对心肌细胞进行电刺激，直到达到稳定状态（25-30次），然后快速灌注10 mM咖啡因以评估SR Ca2+储存在从F/F和PC1 cKO小鼠分离的成年心肌细胞中。钙2+使用Fura-2AM和IonOptix测量瞬态。B。代表性Fura-2AM荧光（激发比340/380nm），用于1 Hz起搏（咖啡因前10个最后瞬变的平均值）。C-G公司。Fura-2荧光瞬态峰值振幅、峰值时间、衰减时间常数（tau）、曲线下面积（AUC）和舒张钙2+水平。A还原钙2+在PC1 cKO心肌细胞中观察到振幅。H。咖啡因诱导（Caff-ind）Ca2+起搏后的瞬态峰值振幅。数据表明SR-Ca2+起搏后PC1 cKO中的存储量减少。伊·J。NCX和SERCA活性（kNCX和kSERCA）使用1 Hz和咖啡因诱发的瞬态衰减率计算。英国。通过全细胞电压钳测量LTCC稳态激活（Imax，最大电流；V，电压）。L。图2B中的代表性数据用于生成模拟F/F和PC1 cKO AP波形的全细胞电压钳的电压刺激曲线。在WT心肌细胞中使用相同细胞和Ca中的不同波形进行AP-clamp2+使用从贴片吸管中装载的Fluo-4进行测量。AP-clamp刺激为1 Hz，连续20次Ca反应2+记录瞬态；对最后5次瞬态进行了平均和分析。M-N公司。PC1 cKO AP波形产生较小的Ca2+与对照心肌细胞中的F/F AP波形相比的瞬态。O-Q公司。钙2+F/F和PC1 cKO心肌细胞在全细胞电压钳下由方形脉冲（+10 mV下20个脉冲，1 Hz下500ms）引发的瞬态（Fluo-4）及其量化（节拍15-20）。数据是从每个基因型的至少三种不同培养物中获得的，每个栏的底部显示“n=细胞”*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001 ns：无显著差异；与F/F.未付吨-测试（除M-N外，成对吨-测试）。
图4：
图4:。PC1控制人胚胎干细胞来源的心肌细胞（hESC-CM）中AP的持续时间。
答：。hESC-CM中TnnI、Actn2、TnT、Nkx2-5和RyR2的代表性免疫染色（Bar=100μm）。B。使用siRNA敲除将PC1蛋白减少80%。使用全细胞电流钳，我们观察到AP持续时间（APD）减少90)PC1缺乏的心肌细胞(C-D公司)（细胞内溶液含有100 nM Ca2+).E类.静息膜电位（Vm）。F、。最大上冲程斜率（dV/dt最大值).G.公司。AP振幅（APA，绝对值）。对于全细胞电流钳，以0.5Hz的频率注入电流以产生AP。H-I.公司。代表性数据来自C类在-80 mV的保持电位下，模拟对照组和PC1-敲除（KD）AP，生成全细胞电压钳的电压刺激曲线。AP刺激为0.5 Hz，Ca连续5次反应2+对瞬态进行平均。PC1-KD AP波形产生较小的Ca2+与控制AP相比的瞬态(我，AUC，曲线下面积）。J。腺病毒介导LacZ或PC1-Ct在hESC-CM中的过度表达（共表达Zsgreen1）。PC1-Ct和GAPDH中所含V5-tag的代表性Western印迹作为负载控制。英国。Zsgreen1荧光图像显示腺病毒感染后hESC-CM的高效转导。L。在hESC-CM中使用全细胞电流钳测量AP。AP持续时间的增加（APD90)PC1-Ct过度表达时观察到(M（M）)，静息膜电位（Vm）无变化，最大上行程斜率（dV/dt最大值)或AP振幅（APA，绝对值）(北-北). 数据是从每种条件下至少三种不同的培养物中获得的，每个条的底部都显示“n=细胞”*P（P）<0.05***P（P）<0.001; ns：无显著差异；与Ctrl-siRNA或LacZ相比。未付款吨-测试（除H-I公司，已配对吨-测试，在同一个单元中进行实验）。
图5：
图5:。向外K增加+PC1 cKO心肌细胞中的电流。
总最大K+用全细胞电压钳测量F/F和cKO小鼠成年心肌细胞在+60 mV下激发25 s的电流。K的三指数拟合+电流显示增加I到，我Kslow1号机组，我Kslow2号机组和我不锈钢PC1-缺陷心肌细胞的最大电流(A-B公司)指数衰减时间常数没有差异(C类).D-电子.我到成年心肌细胞的记录。使用预步骤在−40 mV下进行500 ms以使I失活，从而获得记录到.D。代表性痕迹和I到F/F和cKO成年心肌细胞的测量。E。I的量化到最大电流。F-G公司。文学士2+-敏感IK1型添加100μM Ba后显示的电流2+F/F和PC1 cKO心肌细胞。G.公司。I的量化千1电流。数据是从每个基因型的至少三种不同培养物中获得的，每个栏的底部显示“n=细胞”*P（P）<0.05; **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001; ns：无显著差异；与F/F.未付吨-测试。
图6：
图6:。PC1通过其C端线圈（CC）结构域抑制Kv4.3。
用编码Kv4.3-tGFP、mCherry-PC1-V5（全长PC1；V5标签）、mCherry和EGFP的质粒瞬时转染HEK-293T细胞。答：。用全细胞电压钳测量的Kv4.3电流的代表性迹线。B。Kv4.3的I-V曲线证明了PC1的抑制作用（Imax，最大电流；V，电压）。C、。Western blot分析显示PC1共表达诱导的Kv4.3无差异。PC1蛋白在多个位点发生裂解。PC1全长（FL）、C末端片段（CTF）、N末端片段（NTF）。D。我们评估了PC1-Ct及其CC结构域对Kv4.3电流的影响。IV曲线显示PC1-Ct的抑制作用（与全长PC1相似），而缺少CC结构域的PC1-Ct（PC1-Ct-ΔCC）没有作用。E。Kv4.3最大电流的量化（I最大值)+60 mV（来自面板B类和D类).F、。联合免疫沉淀分析显示Kv4.3和PC1之间存在潜在的相互作用。用Kv4.3-tGFP和mCherry或mCherry-PC1-V5转染HEK细胞。IP、免疫沉淀、IB；免疫印迹。数据是从每种情况下至少三种不同的培养物中获得的，每个图表中都显示“n=细胞”*P（P）<0.05; 与mCh相比。用Dunnett事后检验进行方差分析。
图7：
图7:。PC1 C端建模并与Kv4.3 N端域对接。
答：。PC1蛋白同时显示N端和C端片段。PC1胞质C末端（氨基酸4107-4303）用于从头算建模。TM：跨膜结构域，NLS：核定位信号，CC：线圈结构域，R4228X:PC1突变位于CC内。B。PC1-Ct和Kv4.3 N端细胞质结构域（Kv4.3 T1N螺旋、T1N连接子和T1结构域）之间的模拟复合物。结合到Kv4.3 N末端的PC1-Ct（红色）最低能量络合物的代表性结构（残基1-143，蛋白质数据库（PDB）ID:2I2R，链L，青色）。确定了两个相互作用位点，一个与T1N螺旋(C类，站点1，绿色框）和另一个T1域本身(D类，站点2，蓝色框）。PC1-Ct残留物（绿色棒材）和Kv4.3（黄色棒材）之间的相互作用显示在两个站点1中(C类)和站点2(D类). 仅显示能量贡献小于-1罗塞塔能量单位（R.E.U）的残留物。E类使用Rosetta建模的100个最低能量结构的预计每残渣能量贡献。NLS残基以绿色显示，CC残基以红色显示，其他区域以蓝色显示。误差线对应于所有100个预测结构的标准偏差。F、。Kv4.3和mCh、PC1和PC1 R4228X之间的协同免疫沉淀。Kv4.3能够拉下PC1（全长）和PC1 R4228X。G-H公司。用全细胞电压钳测量Kv4.3电流的代表性迹线和定量，显示PC1的抑制作用，而PC1 R4228X没有影响。数据是从每种情况下至少三种不同的培养物中获得的，每个图表中都显示“n=细胞”**P（P）<0.01ns：无显著差异。用Dunnett事后检验进行方差分析。一、。基于我们的实验数据，我们提出了一个模型，其中PC1通过调节Kv通道控制心脏复极和动作电位持续时间。缩短AP持续时间（APD）会削弱LTCC-RyR2耦合（影响I钙，L平均开启时间）并降低SR-Ca2+SERCA活性的降低进一步加剧了这种情况。总之，这些结果表明PC1调节钙2+成年心肌细胞的循环和收缩性。
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