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.2019年4月15日；8（5）：29。
doi:10.1038/s41389-019-0136-0。

ESCRT-III对于微核核膜的完整性是必要的，但在微核膜破裂时是异常的，会产生损伤

杰西卡·威兰 1 2, Alexa J Cleasby（亚历山大·克莱斯比） 1, Neftali Flores-Rodriguez公司 三, 弗拉维娅·斯特凡尼 4, 辛齐亚·里纳尔多 5 6, 亚历山德拉·皮西奥塔尼 5, 艾玛·格兰特 1 2, 菲利普·伍德曼 7, 海伦·E·布莱恩特 8, 芭芭拉·西亚尼 9
附属公司

ESCRT-III对于微核核膜的完整性是必要的，但在微核膜破裂时是异常的，会产生损伤

杰西卡·威兰等。 肿瘤发生. .

摘要

微核是指细胞试图分隔DNA以保持基因组完整性，从而受到有丝分裂错误和基因毒性事件的威胁。一些微核显示出异常的核膜（NE），核膜崩塌，产生受损的DNA，从而促进复杂的基因组改变。然而，破裂的微核也提供了一个胞质DNA库，可以刺激抗肿瘤免疫，揭示了微核对肿瘤进展影响的复杂性。ESCRT-III（Transport-III所需的内体分选复合物）复合物确保NE在有丝分裂后期重新密封，并在间期修复。因此，ESCRT-III活性可能对维持NE所包围的其他基因组结构的完整性至关重要。NE处的ESCRT-IIII活性由CHMP7亚单位协调。我们表明，CHMP7和ESCRT-III可防止与微核形成相关的基因组不稳定性。ESCRT-III活性的丧失会增加NE破裂的微核数量，这表明其NE修复活性对维持微核完整性也是必要的。令人惊讶的是，在大多数无着丝粒崩溃微核的包膜上发现了ESCRT-III的异常积累，这表明ESCRT-IIII不能从这些结构中有效回收。此外，CHMP7缺失可从ESCRT-III的异常积累中释放微核。CHMP7耗尽的细胞显示出微核减少，其中包含DNA损伤标记物RPA和胞浆DNA传感器。因此，ESCRT-III活性似乎以二分法防止基因组不稳定的后果：ESCRT-IIII膜修复活性可防止包膜薄弱的微核的发生，但ESCRT-II在微核子集上的异常积累似乎会加剧DNA损伤并维持促炎途径。

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数字

图1
图1。CHMP7和VPS4耗竭导致核膜结构紊乱。
一经CHMP7 sRNAi处理48小时的HeLa细胞中蜂窝状和疝出的Lamin A和B表型的例子。箭头显示，疝出细胞中的染色质突出细胞核。b条用所示sRNAi处理的Hela细胞中Lamin A和B缺陷的量化（每种情况至少有300个细胞得分）。c（c）用VPS4和NT对照sRNAi处理48小时的HeLa细胞中CHMP7病灶的示例，与LAP2或Lamin A病灶（富含LAP2和Lamin A，箭头）或与Lamin B孔（HeLa M）相关。d日HeLa中每个核的平均CHMP7病灶数(n个 = 305），希拉·M(n个 = 222）和U2OS(n个 = 257）用VPS4 sRNAi处理细胞48小时。e（电子）在用VPS4 sRNAi处理48小时的HeLa细胞中，CHMP7病灶相对于LAP2、Lamin A/C或Lamin B的定量（每种情况下至少400个病灶）。（f）用VPS4 sRNAi转染HeLa细胞48 h后，CHMP4B与CHMP7在核膜病灶处共定位的去卷积宽视野图像（顶面）和CHMP7/CHMP4B在对照细胞中的分布（底面）。克转染后24、48和72小时VPS4 sRNAi处理后，含有至少一个大量CHMP7（焦点）积累的HeLa细胞的百分比（每种情况下至少有200个细胞核得分）。小时在指定的sRNAi处理下，HeLa M细胞中积累的核CHMP病灶数量。（每种情况至少有100个细胞核得分）。显示了平均值和SEM(N个 = 3). 比例尺代表10μm
图2
图2。ESCRT-III功能受损影响微核完整性。
一用所示的sRNAi转染HeLa细胞48小时，并对每个处理中至少有一个微核的细胞百分比进行量化（每个处理，每个重复至少250个细胞）。结果采用单因素方差分析和Dunnett的事后检验进行分析。b条用指示的sRNAi转染HeLa细胞24、48或72小时。对每一个治疗组的微核细胞数量进行量化（每个治疗组每重复至少对200个细胞进行评分）。结果采用双向方差分析和Dunnett事后检验进行分析。c（c）对每个微核细胞观察到的平均微核数进行了量化（每个处理、每个重复至少150个细胞）。结果采用单因素方差分析和Dunnett的事后检验进行分析。d日用所示sRNAi转染48小时的HeLa细胞中的微核，并对CREST的存在进行评分（每次处理，每次重复至少200个微核）。结果采用单因素方差分析和Dunnett的事后检验进行分析。e（电子）用所示sRNAi转染HeLa细胞48小时，并对Lamin B状态进行评分，如补充图2A所示（每次治疗，每次重复至少100个微核）。结果采用单因素方差分析和Dunnett的事后检验进行分析。显示“缺席”类别的统计信息。（f）用所示sRNAi转染HeLa细胞48小时，并对mab414的状态进行评分，如补充图2B所示（每次治疗，每次重复至少100个微核）。结果采用单因素方差分析和Dunnett的事后检验进行分析。显示“缺席”类别的统计信息。克用指示的sRNAi转染HeLa细胞中的微核48小时，并对微核染色质中PDI的存在进行评分（PDI侵入；每次治疗，每次重复至少100个微核）。结果采用单因素方差分析和Dunnett的事后检验进行分析。小时用指示的sRNAi转染HeLa细胞48小时，并对PARP1的存在进行评分（每次治疗，每次重复至少100个微核）。结果采用单因素方差分析和Dunnett的事后检验进行分析。显示了平均值和SEM(N个 = 3，除非另有说明）。我用对照组或CHMP7 sRNAi处理HeLa细胞，然后在接种后转染GFP-NLS，并在sRNAi缺失48小时后成像。GFP-NLS缺失（顶部面板）或存在（底部面板）的微核示例（箭头）。比例尺10μm。j个GFP-NLS在微核中保留的定量克通过核信号的丢失进行目测判断（每次治疗，每次重复，25个微核得分）。的平均值N个 = 显示了2个生物重复序列
图3
图3。ESCRT-III在微核上积累，并被CHMP7招募。
一未经处理的HeLa细胞在微核（箭头）处显示CHMP7和CHMP4B的积累。比例尺10µm。b条用非靶向或VPS4A和B sRNAi转染U2OS、HeLa和HeLa M细胞系48 h，并进行CHMP7染色。对存在或不存在CHMP7的微核进行评分（每个治疗至少400个微核）。c（c）转染所示sRNAi 48小时后显示CHMP7或CHMP4富集的HeLa细胞微核百分比（每个治疗至少200个微核得分）。d日含有CHMP7和CHMP4B积累的对照HeLa细胞微核的STED模式共聚焦显微镜。比例尺代表1µm。e（电子）STED模式下的共聚焦显微镜观察d日显示了从顶部到微核内部的335nm的z切片。比例尺1μm。显示了平均值和SEM(N个 = 3)
图4
图4。具有CHMP7积累的微核缺乏核纤层完整性、核孔复合体和可溶性核蛋白，但富含LAP2。
一微核的免疫荧光图像，其中CHMP7定位于对照细胞中拉明B间隙区域（顶部面板）。对照HeLa细胞（底部面板）中CHMP7-阳性（箭头）和阴性（箭头）的示例。比例尺3µm。b条CHMP7和Lamin B在微核中的状态分布（每个重复至少100个微核得分）。c（c）对照HeLa细胞中带有NPC染色的CHMP7-阳性和阴性微核示例。d日在同一微核内，对HeLa细胞的微核进行CHMP7状态和NPC状态（mab414）评分（每个重复至少160个微核评分）。e（电子）CHMP7-阳性微核和阴性微核的示例显示没有或存在PARP1染色。比例尺3µm。（f）同一微核内是否存在PARP1和CHMP7染色的量化（每个重复至少200个微核得分）。克LAP2染色的CHMP7-阳性和阴性（箭头）微核示例。比例尺3µm。小时同一微核内是否存在LAP2和CHMP7染色的量化（每个重复300个微核）。使用Fishers关于混合原始计数分布的精确检验对数据进行分析(N个 = 3)
图5
图5。具有ESCRT-III积聚的微核显示内质网膜浸润。
一PDI染色的CHMP7-阳性和阴性微核示例。PDI排除的微核边界周围有内质网膜，但微核内部没有内质网。PDI侵入的微核显示微核边界内的内质网膜，表明核膜塌陷（箭头）。b条同一微核内CHMP7状态的分布和PDI侵袭的存在或不存在（每个重复至少100个微核得分）。使用Fishers对合并原始计数分布的精确检验对数据进行分析(N个 = 3).c（c）用VPS4 sRNAi处理48小时后Hela细胞微核的示例图像。微核内PDI和CHMP7的积累以及不规则形状的膜渗透（箭头）。比例尺3µm
图6
图6。ESCRT-III优先在无着丝粒微核上积累。
一用对照或VPS4 sRNAi转染HeLa细胞48小时，并对其进行CREST共染色，以检测着丝粒、CHMP7和DAPI。CHMP7+ve微核示例为CREST+ve（箭头表示弱CREST信号）或CREST-ve（箭头表明无CREST信息）。比例尺10µm。b条对含有至少一个明确CREST病灶的HeLa细胞中的微核进行定量，CREST病灶类似于在原代细胞核和CHMP7中发现的CREST病灶（每次重复至少有200个微核得分）。使用Fishers精确检验对汇总数据进行结果分析。单个生物重复对Fishers来说也很重要(第页 < 0.05）。c（c）对照HeLa细胞进行CHMP7和DAPI染色。在ImageJ中测量的微核直径（75 CHMP7阳性和75 CHMP7-阴性微核）。用sRNAi转染HeLa细胞48小时，染色显示CREST、CHMP7和DAPI。d日–小时HeLa细胞用10 mJ/cm2UV-C照射剂量，并在治疗后的不同时间点固定。对细胞进行γH2AX、CHMP7和DAPI染色。d日从UV-C（比例尺10µm）中恢复后24和48小时，对照细胞和细胞中单个微核内CHMP7和γH2AX的累积。UV-C处理后每个细胞的微核数如所示e（电子）.对微核的存在进行评分（f）CHMP7累积和克γH2AX病灶，含有至少一个病灶的微核被视为阳性（每个治疗400个细胞）。γH2AX和CHMP7的微核阳性率如所示小时。该百分比是根据每个时间点计数的微核总数计算的，最小值为50，最大值为285。显示了平均值和SEM(N个 = 3). 使用单因素方差分析和Dunnett的事后检验对结果进行分析
图7
图7。CHMP7对产生微核损伤DNA非常重要。
一控制含有RPA70和CHMP4B微核阳性或阴性的HeLa细胞。顶部面板：箭头显示RPA70和CHMP4B的微核阴性。下图：箭头显示RPA70和CHMP4B的微核呈阳性。比例尺3µm。b条对照HeLa细胞中的微核对CHMP7状态和同一微核内是否存在单链DNA（RPA70）进行评分（每个重复至少115个微核）。使用Fishers对混合原始计数分布的精确检验分析数据(N个 = 3).c（c）控制微核cGAS和CHMP7阳性或阴性的HeLa细胞。顶部面板：箭头显示cGAS（红色）和CHMP7（绿色）的微核阳性。底部面板：箭头显示cGAS（绿色）和CHMP7（红色）的微核阴性。比例尺3µm。d日对照HeLa细胞中的微核对CHMP7状态和同一微核内cGAS的存在或不存在进行评分（每个重复至少150个微核得分）。使用Fishers对混合原始计数分布的精确检验分析数据(N个 = 3).e（电子）用指示的siRNA转染HeLa细胞的微核48小时，并对RPA70信号的富集进行评分（每次治疗、每次重复至少50个微核总评分）。结果采用单因素方差分析和Dunnett的事后检验进行分析。所示平均值和SEM(N个 = 3).（f）上图：CHMP7缺失48小时的HeLa细胞（箭头显示RPA70+ve微核；填充的箭头显示RPA70-ve微核）。底部面板：耗尽VPS4 48小时的HeLa细胞（箭头显示RPA70+ve和CHMP4B+ve微核）。比例尺10μm。克用指示的siRNA转染HeLa细胞中的微核48小时，并对cGAS信号的富集进行评分（每次治疗，每次重复至少55个微核）。结果采用单因素方差分析和Dunnett的事后检验进行分析。所示平均值和SEM(N个 = 3).小时顶部面板：CHMP7耗尽HeLa细胞48小时（箭头显示cGAS+ve微核；填充的箭头显示cGAS-ve微核）。CHMP7通道过度暴露3倍，以突出微核上CHMP7积累的缺失。底部面板：HeLa细胞耗尽VPS4 48小时（箭头显示cGAS+ve微核；箭头所示为CHMP7核聚集体的cGAS富集）。比例尺10μm。（f）和小时曝光时间已经过调整，以补偿CHMP7和VPS4击倒实验之间信号强度的变化
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