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.2019年6月；33(6):7778-7790.
doi:10.1096/fj.201802799R。 Epub 2019年3月20日。

PDK4导致癌症恶病质患者的代谢改变和肌肉萎缩

Fabrizio引脚 1 2, Leah J Novinger公司 三, 约书亚·R·霍特 2 4, 罗伯特·哈里斯 5, Marion E沙发 2 三 6 7, 托马斯·奥康奈尔 2 三 6 7, 安德烈亚·博内托 1 2 三 4 6 7
附属公司

PDK4导致癌症恶病质患者的代谢改变和肌肉萎缩

Fabrizio引脚等。 美国财务会计准则委员会J. 2019年6月.

摘要

恶病质经常伴有严重的代谢紊乱，尽管导致这种衰弱状态的机制尚不清楚。丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）4是细胞能量代谢的关键调节因子，在癌症、饥饿、糖尿病和脓毒症的实验模型中发现其升高。在这里，我们旨在研究PDK4与癌症恶病质患者肌肉大小变化之间的联系。在结肠-26肿瘤宿主的骨骼肌以及喂食富含Pirinixic acid的饮食的小鼠中发现PDK4高和能量代谢异常，之前的研究表明PDK4水平升高。在肌管培养物中，病毒介导的PDK4过度表达足以促进肌纤维收缩，这与蛋白质分解代谢增强和线粒体异常一致。相反，阻断PDK4足以恢复C2C12培养液中暴露于肿瘤介质的肌管大小。我们的数据首次支持PDK4在促进癌相关肌肉代谢改变和骨骼肌萎缩中的直接作用-Pin，F.、Novinger，L.J.、Huot，J.R.、Harris，R.A.、Couch，M.E.、O'Connell，T.M.、Bonetto，A.PDK4推动癌性恶病质的代谢改变和肌肉萎缩。

关键词：C2C12肌管；化疗；能量代谢；线粒体；骨骼肌萎缩。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者感谢印第安纳大学（IU）医学院癌症中心使用在体内治疗学核心设施，产生本研究中使用的NSG小鼠。由J.Frankel和E.M.Nelson（美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学）开发的12G10抗微管蛋白单克隆抗体和Donald A.Fischman（美国纽约州伊萨卡市康奈尔大学）研发的MF-20抗肌球蛋白重链抗体是从美国国立卫生研究院创建的发育研究杂交瘤库中获得的，国家儿童健康研究所，并在爱荷华大学生物系任职。作者感谢John Spence博士在编辑手稿方面所做的贡献，以及Teresa A.Zimmers博士（均来自IU医学院）允许访问以下设备体内恶病质的特征。本研究得到了IU外科和耳鼻喉科头颈外科的支持，以及V癌症研究基金会（V2017-021 to A.B.）、美国癌症协会（研究学者基金会132013-RSG-18-010-01-CCG to A.B，IU Simon癌症中心（A.B.的准成员试点资助机制）、印第安纳临床与转化科学研究所（T.M.O.和A.B.的核心试点拨款UL1TR001108）和Showalter研究信托基金（A.B.）。作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
PDK4在在体外癌性萎缩模型。A类)暴露于对照培养基（25%UCM）或25%C26CM长达48小时的C2C12肌管的代表性图像。对细胞层进行MitoTracker Red CMXRos染色，并对红色荧光强度（极化线粒体）的定量进行归一化与。DAPI（细胞核）表示为任意单位（a.u.）。通过测量每个实验条件下250–350个肌管的最小直径来确定肌管的尺寸(n个= 3). 比例尺，100μm。B类)暴露于C26 CM的C2C12肌管全蛋白提取物中PDK4的典型Western印迹(n个= 3). 采用Tubulin作为负荷控制。数据（平均值±标准偏差)表示为褶皱变化与。UCM*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001.
图2
图2
C26肿瘤引起显著的代谢紊乱。A类)对照组和C26荷瘤小鼠（C26）腓肠肌PDH和SDH酶活性的评估。PDH的数据用mU/ml表示，SDH的数据则用mU/μl表示。B类)C26肿瘤小鼠全肌蛋白提取物中PDK4的典型蛋白质印迹(n个= 8). 采用Tubulin作为负荷控制。数据（平均值±标准偏差)表示为褶皱变化与。控件*P（P）<0.05时**P（P）< 0.01.
图3
图3
PDK4激活物WY-14643决定肌管萎缩。A类)评估用WY-14643处理长达48小时的C2C12培养物中的肌管大小。在每个实验条件下，平均测量250–350个肌管，一式三份。绿色染色：肌球蛋白重链。比例尺，100μm。B类)WY-14643处理的C2C12全蛋白提取物中PDK4的典型Western印迹(n个= 3). 采用Tubulin作为负荷控制。数据（平均值±标准偏差)表示为褶皱变化与。控件*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001.
图4
图4
体内WY-14643给药诱导恶病质表型。A类–C类)累积食物摄入量(A类)，体重曲线(B类)和体重变化(即，安乐死时的体重与。初始体重）(C类)喂食富含0.1%WY-14643的食物的小鼠。D类)通过EchoMRI对喂食WY-14643的小鼠进行身体成分评估。数据以安乐死时脂肪或瘦组织的克数表示。E类)喂食对照组或WY-14643强化饮食的小鼠后肢肌肉组织的代表性图像。F类)喂食对照组或WY-14643饮食的小鼠的骨骼肌重量（胫骨前肌、腓肠肌和股四头肌）。重量标准化为初始体重（IBW），并表示为重量/100 mg IBW；n个= 8. 数据为平均值±标准偏差. *P（P）<0.05时**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与。控制。
图5
图5
服用WY-14643会导致肌肉萎缩和线粒体改变。A类)苏木精-伊红（H&E）和SDH染色的对照组和WY-14643治疗组小鼠胫骨前肌10μm厚切片的代表性图像。比例尺，100μm。B类)喂食富含WY-14643的食物的小鼠胫骨前肌部分的CSA。C类)对照组和WY-14643治疗组小鼠SDH积分密度的量化。数据表示为任意单位（a.u.）。D类)氧化纤维（深蓝色）和糖酵解纤维（浅蓝色）的数量（表示为对照组的百分比）。E类)对照组和WY-14643治疗组动物腓肠肌中的SDH和PDH酶活性。SDH的数据用mU/μl表示，PDH的数据则用mU/ml表示。F类)PDK4、PGC1α、OPA1、Mitofusin 2和细胞色素的典型蛋白质印迹c（c）在喂食对照组或WY-14643饮食的小鼠的全肌肉蛋白质提取物中。采用Tubulin作为负荷控制。G公司)实时定量PCR检测泛素连接酶的基因表达水平。基因表达标准化为TATA-结合蛋白水平。数据（平均值±标准偏差)表示为褶皱变化与。控制；n个= 8. *P（P）<0.05时**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图6
图6
PDK4过度表达影响C2C12肌管大小和代谢。A类)PDK4（以低暴露时间和高暴露时间显示）、PGC1α、OPA1、Mitofusin 2、细胞色素的代表性蛋白质印迹和定量c（c）以及感染Ad-GFP或Ad-GFP-mPDK4的C2C12肌管中的泛素标记蛋白(n个= 3). 采用Tubulin作为负荷控制。B类)感染Ad-GFP或Ad-GFP-mPDK4的C2C12肌球蛋白重链免疫荧光染色(n个=3）和肌管大小量化。每个实验条件下平均测量250-350个肌管，一式三份。比例尺，100μm。C类)感染Ad-GFP和Ad-GFP-mPDK4的C2C12肌管中丙酮酸脱氢酶（PDH）和琥珀酸脱氢酶的酶活性。数据表示为PDH的每毫升毫升数或SDH的每微升毫升数。D类)感染Ad-GFP或Ad-mPDK4的C2C12肌管线粒体呼吸和耗氧率(n个= 3). 三磷酸腺苷；BR，基础呼吸；MR，最大呼吸；PL，质子泄漏；SRC，备用呼吸容量。数据（平均值±标准偏差)以皮摩尔每分钟表示。数据（平均值±标准偏差)报告为折叠变化与.广告-GFP*P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）< 0.001与Ad-GFP（差异的显著性）。
图7
图7
PDK4缺失保护C2C12肌管免受肿瘤诱导的萎缩。A类)肌球蛋白重链染色C2C12肌管的代表性图像，分别用Ad-shScr或Ad-shPDK4单独感染或与25%对照培养基（25%UCM）或25%C26 CM联合感染48小时。数据（平均值±标准偏差)表示为微米。平均而言，每个实验条件下测量250–350个肌管，一式三份。比例尺，100μm。B类)感染Ad-shScr或Ad-shPDK4并暴露于C26 CM达48小时的C2C12肌管全蛋白提取物中PDK4的代表性Western blotting用作负荷控制。C类)感染Ad-shScr或Ad-shPDK4并暴露于C26 CM长达48小时的C2C12肌管中PDH酶活性数据（平均值±标准偏差)表示为mU/ml**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与。UCM、，$P（P）< 0.05,$$$P（P）< 0.001与。Ad-shScr+UCM，#P（P）< 0.05,###P（P）< 0.001与。Ad-shScr+C26 CM。
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