Dysfunction of GRAP, encoding the GRB2-related adaptor protein, is linked to sensorineural hearing loss

doi:10.1073/pnas.1810951116

.2019年1月22日；116(4):1347-1352.

doi:10.1073/pnas.1810951116。 Epub 2019年1月4日。

的功能障碍抓地力编码GRB2相关适配器蛋白，与感音神经性聋有关

附属公司

¹迈阿密大学米勒医学院分子和细胞药理学系，佛罗里达州迈阿密，邮编33136。
²佛罗里达州迈阿密市迈阿密大学米勒医学院人类基因组研究所John P.Hussman，邮编33136。
^三土耳其伊兹密尔阿塔图尔克教育研究医院医学遗传学系，35360。
⁴烟台大学药学学院、教育部分子药理学与药物评价重点实验室（烟台大学）、山东省高校先进给药系统与生物技术药物协同创新中心、烟台大学，中国山东省烟台市264005。
⁵土耳其安卡拉06260安卡拉大学医学院儿科遗传学系。
⁶土耳其安卡拉06260安卡拉大学医学院听力学系。
⁷约翰·麦克唐纳博士基金会人类遗传学系，迈阿密大学米勒医学院，佛罗里达州迈阿密，邮编33136。
⁸佛罗里达州迈阿密市迈阿密大学米勒医学院耳鼻喉科，邮编33136。
⁹佛罗里达州迈阿密市迈阿密大学米勒医学院生物化学和分子生物学系，邮编33136。
¹⁰迈阿密大学米勒医学院分子和细胞药理学系，迈阿密，佛罗里达州33136；zhzai@med.miami.edu mtekin@med.miami.edu。
¹¹佛罗里达州迈阿密市迈阿密大学米勒医学院人类基因组研究所约翰·胡斯曼（John P.Hussman），邮编33136；zhzai@med.miami.edu mtekin@med.miami.edu。

PMID： 30610177
预防性维修识别码： PMC6347722
内政部： 10.1073/pnas.1810951116

的功能障碍抓地力编码GRB2相关适配器蛋白，与感音神经性聋有关

李冲（Chong Li）等。美国国家科学院程序. 2019.

.2019年1月22日；116(4):1347-1352.

doi:10.1073/pnas.1810951116。 Epub 2019年1月4日。

附属公司

¹迈阿密大学米勒医学院分子和细胞药理学系，佛罗里达州迈阿密，邮编33136。
²佛罗里达州迈阿密市迈阿密大学米勒医学院人类基因组研究所John P.Hussman，邮编33136。
^三土耳其伊兹密尔阿塔图尔克教育研究医院医学遗传学系，35360。
⁴烟台大学药学学院、教育部分子药理学与药物评价重点实验室（烟台大学）、山东省高校先进给药系统与生物技术药物协同创新中心、烟台大学，中国山东省烟台市264005。
⁵土耳其安卡拉06260安卡拉大学医学院儿科遗传学系。
⁶土耳其安卡拉06260安卡拉大学医学院听力学系。
⁷约翰·麦克唐纳博士基金会人类遗传学系，迈阿密大学米勒医学院，佛罗里达州迈阿密，邮编33136。
⁸佛罗里达州迈阿密市迈阿密大学米勒医学院耳鼻喉科，邮编33136。
⁹佛罗里达州迈阿密市迈阿密大学米勒医学院生物化学和分子生物学系，邮编33136。
¹⁰迈阿密大学米勒医学院分子和细胞药理学系，迈阿密，佛罗里达州33136；zhzai@med.miami.edu mtekin@med.miami.edu。
¹¹佛罗里达州迈阿密市迈阿密大学米勒医学院人类基因组研究所约翰·胡斯曼（John P.Hussman），邮编33136；zhzai@med.miami.edu mtekin@med.miami.edu。

PMID： 30610177
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内政部： 10.1073/pnas.1810951116

摘要

我们已经确定了抓地力变异株（c.311A>T；p.Gln104Leu）与两个不相关家族中的常染色体隐性非综合征性耳聋共群。抓地力编码高度保守的生长因子受体结合蛋白2（GRB2）/Sem-5/drk蛋白家族成员，参与Ras信号传导；然而，生长因子受体结合蛋白2（GRB2）相关衔接蛋白（GRAP）在听觉系统中的功能尚不清楚。在这里，我们用鼠标显示，葡萄在内耳中表达，该蛋白定位于神经纤维，神经纤维支配耳蜗和心室听毛细胞。受体激酶下游(drk公司)，的果蝇属人类同源物抓地力表达为约翰斯顿器官（JO）、苍蝇听觉器官和drk公司在JO中引起scolopidium异常。drk公司突变果蝇表现出负向趋地性行为缺陷，这可以被人类野生型而非突变GRAP抑制。此外，drk在突触处与突触蛋白特异性共定位，表明这种衔接蛋白在调节神经系统中肌动蛋白细胞骨架动力学方面具有潜在作用。我们的发现在抓地力突变和非综合征性耳聋，并提示GRAP/drk在听力中的功能。

关键词：果蝇；抓地力；衔接蛋白；drk；非综合征性听力损失。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
非综合征性重度耳聋在纯合子为*抓地力*变体。(一)家谱和种族隔离*抓地力*c.311A>家族1和家族2中的T变异体。(B类)从表现出严重到严重HL的受影响个体的纯音听力图中获得的听力阈值。未受影响的人表现出正常的听力。听力图显示的是年龄。(C类)显示已识别变体的电泳图。野生型（WT）痕迹来自无关个体。Hom，纯合突变体，Het，杂合突变体。(D类)不同物种GRAP部分SH2结构域的氨基酸序列。氨基酸Gln104（Q104）在哺乳动物中高度保守。

**图2。**
葡萄在小鼠内耳中表达。(一)的RT-PCR葡萄在胚胎第17.5天和出生后第15天，在不同的小鼠组织中表达。*Gapdh公司*表达作为对照。Co，耳蜗；Cx，皮层；Hi，海马；*K（K）*_我，肾；李，肝脏；卢，肺。(B类)的代表性z堆栈投影*P（P）*₀整个耳蜗山被葡萄染色（绿色）。红色信号对应于染色毛细胞螺旋神经节神经元（SGN）神经支配的神经丝（NF）重链。细胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）复染。注意Grap在神经长度上的定位。（比例尺：10µm）(C类)黑白图像表示Grap和NF的同位化，这是同位化荧光笔插件（ImageJ）的结果。

**图3。**
drk是*果蝇属*人类GRAP的同源物，在脊椎动物中表达。(一)人类、小鼠和*果蝇属*适配器蛋白GRAP/GRB2/drk通过全长氨基酸的一致性和相似性进行评分。(B类)图示GRAP和drk的蛋白质结构的图表。部分SH2结构域的序列比对显示进化保守性（黑色背景表示相同的氨基酸，灰色背景表示相似的氨基酸）。红色箭头表示非综合征HL患者的突变。黄色箭头表示*果蝇属*突变等位基因。(C类)示意图显示*果蝇属*天线。机械感觉神经元（用青色标记）悬浮在JO内，JO是飞行天线的A2段。(D类)示意图显示了一个分叶虫的组织（C类). (电子)共焦显微照片显示了drk在JO中的表达模式。DAPI标记细胞核，辣根过氧化物酶（HRP）标记神经元膜，以及指骨素标记纤毛中的帽杆、头帽杆和肌动蛋白束。(F类)脊柱侧凸高倍共聚焦显微照片电子). （比例尺：电子和F类，10微米）

**图4。**
drk在层突触与突触蛋白共定位。(一和B类)共焦显微照片显示了drk在椎板突触内的定位。Brp标记活动分区结构。CSP标记突触小泡(一)，和突触素(B类)与突触前终末内的小泡和细胞骨架有关。（比例尺：5µm）(C类)示意图显示突触前终末膜内突触蛋白的定位。

**图5。**
*drk公司*突变会导致脊椎动物的形态异常和运动障碍，这些都可以被GRAP抑制^重量但不是GRAP³¹¹表达式。(一)热图显示了*drk公司*成虫存活的复合杂合子苍蝇。*drk公司*¹⁴⁻⁷,*drk公司*⁶、和*drk公司*^电子0AEMS诱导的突变等位基因和*drk公司*^Δ是一个缺失等位基因。(B类)负向趋地性表现[平均值±平均值的标准误差；从9或10个人组成的组中获得的每个数据点，n个=5，用于*drk公司*⁶*/drk公司*¹⁴⁻⁷组（由于生存率低）和n个羽化后2天，雌性苍蝇的所有其他组（每个测试基因型>100只苍蝇）=10（DAE）。(C类)共聚焦显微照片显示了蜈蚣肌动蛋白束的形态。两者都有*drk公司*⁶*/drk公司*¹⁴⁻⁷和*drk公司*⁶*/drk公司*^电子0A苍蝇具有杂乱无章的生殖肽染色模式（白色箭头）。(D类)利用AMMC的可抑制细胞标记分析进行镶嵌分析。绿色荧光蛋白（GFP）标记WT斑块*eyFLP；国际标准化组织*组，和*drk公司*^Δ/Δ中的修补程序*eyFLP公司*;*drk公司*^Δ组。(电子)AMMC区域的量化D类（平均值±标准偏差；n个= 3). （比例尺：10µm）单向方差分析-事后Tukey检验***P（P）*< 0.01. ns，不显著。

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