Withaferin A inhibits Epithelial to Mesenchymal Transition in Non-Small Cell Lung Cancer Cells

doi:10.1038/s41598-018-34018-1

.2018年10月24日；8(1):15737.

doi:10.1038/s41598-018-34018-1。

威沙芬A抑制非小细胞肺癌细胞的上皮细胞向间充质细胞转化

Al Hassan Kyakulaga公司¹, Farrukh Aqil公司^2 三, Radha Munagala公司^2 三, 拉梅什·古普塔^4 5

附属公司

¹路易斯维尔大学药理学和毒理学系，路易斯维尔，肯塔基州40202，美国。
²美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学医学系，邮编40202。
^三詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心，路易斯维尔大学，路易斯维尔，肯塔基州，40202，美国。
⁴路易斯维尔大学药理学和毒理学系，路易斯维尔，肯塔基州40202，美国。rcgupta@louisville.edu。
⁵詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心，路易斯维尔大学，路易斯维尔，肯塔基州，40202，美国。rcgupta@louisville.edu。

PMID： 30356176
预防性维修识别码： PMC6200817型
内政部： 10.1038/s41598-018-34018-1

威沙芬A抑制非小细胞肺癌细胞的上皮细胞向间充质细胞转化

Al Hassan Kyakulaga公司等。科学代表. 2018.

.2018年10月24日；8(1):15737.

doi:10.1038/s41598-018-34018-1。

作者

Al Hassan Kyakulaga公司¹, Farrukh Aqil公司^2 三, 拉德哈·穆纳加拉^2 三, 拉梅什·C·古普塔^4 5

附属公司

¹路易斯维尔大学药理学和毒理学系，路易斯维尔，肯塔基州40202，美国。
²美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学医学系，邮编40202。
^三詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心，路易斯维尔大学，肯塔基州路易斯维尔，40202。
⁴路易斯维尔大学药理学和毒理学系，路易斯维尔，肯塔基州40202，美国。rcgupta@louisville.edu。
⁵詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心，路易斯维尔大学，肯塔基州路易斯维尔，40202。rcgupta@louisville.edu。

PMID： 30356176
预防性维修识别码： PMC6200817型
内政部： 10.1038/s41598-018-34018-1

摘要

肺癌是全世界和美国癌症相关死亡的主要原因。尽管最近治疗方法取得了进展，但转移仍是肺癌的主要治疗挑战，并解释了其预后极差的原因。上皮-间充质转化（EMT）是一个复杂的细胞重编程过程，由于其在非小细胞肺癌（NSCLC）的转移中起着至关重要的作用，已成为一个引人注目的药物靶点。在本研究中，我们检测了维他福林A（WFA），一种植物源性甾体内酯对人类非小细胞肺癌细胞系EMT的影响。首先，我们证明WFA对A549和H1299非小细胞肺癌细胞具有时间和浓度依赖性的细胞毒性。然后，将细胞暴露于≤0.5µM WFA中≤4 h，以最小化细胞毒性，并测定其对EMT、细胞粘附、运动、迁移和侵袭的影响。通过在含有TGFβ1（5 ng/mL）和TNFα（25 ng/mL）的无血清培养基中培养细胞48 h，进行EMT诱导。我们观察到，用WFA预处理细胞可抑制A549和H1299细胞的粘附、迁移和侵袭。通过western blot、免疫荧光和qRT-PCR分析，我们证明WFA抑制了两种细胞系中TGFβ1和TNFα诱导的EMT。WFA在机制上抑制A549和H1299细胞中Smad2/3和NF-κB的磷酸化和核移位。总之，我们的研究提供了额外的证据，证明了WFA对非小细胞肺癌细胞EMT诱导的抑制作用，并进一步证明了WFA对非大细胞肺癌转移的治疗潜力。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
WFA抑制A549和H1299细胞的生长和增殖。(一个)WFA的化学结构。(B类)相控图像（4倍放大）显示与WFA孵育48小时后的细胞形态(C类)培养72小时后WFA对A549和H1299细胞的剂量依赖性抗增殖活性。WFA对A549生长和增殖的时间和浓度依赖性抑制作用(D类)和(E类)H1299细胞。(F类)描述WFA对A549和H1299细胞的剂量依赖性抑制作用的集落形成分析的代表性图像。使用MTT法测量细胞活力，同时使用显微镜计算形成的菌落数，数据表示为3个技术复制品的平均值±SD*p<0.05，**p<0.01。

图2
WFA抑制A549和H1299细胞的粘附、运动、迁移和侵袭。(一个)描述A549和H1299细胞粘附的剂量依赖性抑制的细胞粘附试验。(B类)伤口愈合试验显示WFA对A549和H1299细胞运动的抑制作用。(C类)显示WFA对A549和H1299细胞与WFA孵育后跨阱迁移和侵袭的影响的典型图像。数据为平均值±标准偏差，*p<0.05。

图3
WFA抑制A549和H1299细胞的实验性EMT诱导。细胞未经处理或用0.5µM WFA预处理12 h，然后用TGFβ1或TNFα单独或联合在无血清培养基中刺激。通过蛋白质印迹分析、qRT-PCR和免疫荧光染色评估EMT诱导。(一个)Western blot分析描述上皮标记物E-cadherin和EMT相关蛋白N-cadherin、蜗牛、波形蛋白和纤维连接蛋白的表达水平(B类)qRT-PCR描述相对mRNA表达。使用^ΔΔCт法和GAPDH作为正常化基因。(C类)相控图像（4x放大）和共聚焦图像显示在有或无0.5µM WFA的情况下与TGFβ1和TNFα联合培养A549细胞后，细胞形态以及E-cadherin和vimentin表达的变化。（*p<0.05）。

图4
WFA抑制TGFβ1/TNFα诱导的A549和H1299细胞运动。伤口愈合试验用于测量细胞在0.5µM WFA和TGFβ1（5 ng/mL）和TNFα（25 ng/mL。图中显示细胞因子TGFβ1和TNFα显著增强A549的运动能力(一个)和H1299（B）细胞。然而，在WFA存在下，TGFβ1/TNFα诱导的运动受到抑制。将0 h时的伤口面积视为100%，数据表示为迁移百分比（平均值±SD）。（*p<0.05）。

图5
WFA抑制A549和H1299细胞中TGFβ1依赖性Smad2/3的激活(一个)A549非小细胞肺癌细胞的共焦图像，描绘了WFA（1.0µM）对A549细胞中TGFβ1（5 ng/mL）诱导的Smad2/3磷酸化的抑制作用。(B类)全细胞裂解物的Western blot分析显示WFA对Smad2/3信号通路的剂量依赖性抑制作用(C）对A549细胞胞浆和核组分的Western blot分析显示，WFA存在时Smad2/3磷酸化和核移位降低。GAPDH被用作总蛋白负荷控制。

图6
抑制TNFα诱导的人非小细胞肺癌细胞NFκB活化。(一个)共聚焦图像（40倍放大）显示p-NF-κB的水平。(B类)Western blot分析显示TNFα（25 ng/mL）刺激后全细胞裂解物中p-NFκB、总NF-kB、p-IκB和总IκB的水平(C类)核和细胞溶质细胞提取物的Western blot分析显示了TNFα刺激后NFκB、p-NFκ的B、IκBα和p-Iκ的Bα水平。(D类)电泳迁移率变化分析表明NF-κB与DNA结合受到抑制。细胞与WFA孵育4 h，然后用TNFα（25 ng/mL）刺激。条带强度表示DNA结合的程度。

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