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.2018年9月6日；71（5）：718-732.e9。
doi:10.1016/j.molcel.2018.07.031。

磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的动态乙酰化在葡萄糖生成反应和回复反应之间切换酶活性

佩德罗·拉托雷·穆罗 1, Josue Baeza公司 2, 埃里克·A·阿姆斯特朗 2, 拉蒙·赫塔多·格雷罗 三, 弗朗西斯科·科扎纳 4, 林赛·E·吴 5, 大卫·A·辛克莱 6, 帕斯卡尔·洛佩斯·布埃萨 1, 何塞·A胡萝卜 7, 约翰·M·德努 8
附属公司

磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的动态乙酰化在葡萄糖生成反应和回复反应之间切换酶活性

佩德罗·拉托雷·穆罗等。 分子电池. .

摘要

胞浆磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK1）被认为是一种糖异生酶；然而，其代谢功能和糖异生以外的调控机制尚不清楚。在这里，我们描述了PCK1的动态乙酰化在糖异生和回复活性之间相互转换酶。在高糖条件下，PCK1的p300依赖性超乙酰化并没有导致蛋白质降解，而是增加了PCK1执行回补反应的能力，将磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸。Lys91乙酰化破坏PCK1活性部位的稳定性，有利于反向反应。在低能量输入下，我们证明SIRT1使PCK1脱乙酰化并完全恢复PCK1的糖原生成能力。此外，我们发现GSK3β介导的PCK1磷酸化降低乙酰化并增加泛素化。生化证据表明，与Lys91相邻的丝氨酸磷酸化刺激PCK1的SIRT1依赖性去乙酰化。这项工作揭示了超乙酰化PCK1促进回补活性的意外能力，以及PCK1翻译后控制的交叉点，包括乙酰化、磷酸化和泛素化。

关键词：乙酰化；乙酰转移酶；回补；糖异生；代谢；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；磷酸化；翻译后修饰；监管；西尔图。

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数字

图1。
图1.PCK1蛋白水平不受葡萄糖浓度的影响。
（A） PCK1蛋白水平在广泛的葡萄糖浓度范围内保持不变。HEK293T细胞暴露于不同葡萄糖浓度下，n=3。（B） HepG2细胞内源性PCK1蛋白水平在广泛的葡萄糖浓度范围内没有显著变化（n=4）。（C） 在HEK293T和HepG2细胞中进行与（A）和（B）相同的实验，但使用含有FBS的培养基（n=2）。在A-C中，左边的数字表示分子量（kDa）。表示平均值±SD。显著性指的是2.5 mM条件，*p<0.05。
图2。
图2.P300介导的乙酰化修饰PCK1活性。
（A） 葡萄糖浓度影响细胞中PCK1的活性。从暴露于不同葡萄糖浓度的HEK293T细胞中纯化的PCK1的活性在两个反应方向上进行了测量。重组PCK1纯化自大肠杆菌用作对照（见图S1A）。（B） 重复（A）中描述的实验，但同时联合转染PCK1和人类p300。（见图S1A和S1B）。（C） 重复（A）中描述的实验，但使用C646在10μM下抑制p300 24小时。（D） 细胞培养基中葡萄糖的存在改变了内源性PCK1的活性。使用HEK293T和HepG2细胞（n=3）的细胞溶质组分在两个反应方向上测量PCK1活性。（E-H）SIRT1在两个反应方向上恢复PCK1活性。在重组SIRT1或SIRT2处理后，在（D）OAA→PEP和（E）PEP→OAA反应方向测定实验（A）获得的PCK1活性。（F） 和（G）的实验与（D）和（E）相同，但使用实验（B）中的蛋白质。在（A-H）中，表示平均值±SD。将每种条件下的PCK1活性与从2.5 mM条件下纯化的PCK1.活性进行比较。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，A-D中n=3，E-H中n=2。仅表示正文中提及的值。（一） 乙酰化修饰PCK1的糖异生活性。在过度表达PCK1、SIRT1和p300的不同组合的HEK293T细胞中测定葡萄糖生成。图表表示培养6小时后的葡萄糖生成。表示平均值±SD，n=3，**p<0.01。（见图S1C）。（J） 图2I所示的葡萄糖检测期间不同蛋白质的过度表达。左侧的数字表示分子量（kDa）。
图3。
图3.Lys91乙酰化修饰PCK1活性。
（A） 葡萄糖增加PCK1乙酰化。使用图2A中的样品通过western blot分析PCK1乙酰化。数字表示分子量（kDa）（见图S2A和表S1）。（B） 葡萄糖决定PCK1 Lys91乙酰化水平。从暴露于不同葡萄糖浓度的HEK293T中纯化PCK1。在MS分析之前，PCK1在SIRT1（SIRT1）或SIRT2（SIRT2）的存在下培养。乙酰化化学计量以百分比（%）表示。（C） Lys91ac提高了政治公众人物和GDP的催化效率。政治公众人物、国内生产总值和韩国霍奇金公司的迈克尔斯-曼顿对比图三（另请参见图S2E和S2F以及表S2和S3）。（D） Lys91ac增加丙酮酸激酶活性。丙酮酸激酶活性的比较Michaelis-Menten图（另见图S2G和表S3C。（E）Lys91ac使PCK1的闭合状态不稳定。烯醇化物保留率的迈克尔利斯·蒙顿比较图。（见图S2H和表S3D）。在D和E中，表示平均值±SD，n=3。（F） Lys91ac修改了R-Loop和Ω-Loop的行为。PCK1（左）和K91AcK变体（右）的原子涨落。（另请参见图S3和电影S1–S4）。颜色栏表示距离（Ω）。
图4。
图4 PCK1能够在HEK293T细胞中进行反向（PEP→OAA）反应。
（A） PCK1过度表达导致PC下调。用PCK1构建物或siPC寡核苷酸或两者联合转染HEK293T细胞，并用western blotting检测PC（α-PC）、PCK1过表达（α-HA）和内源性PCK1（α-PCK1）的蛋白表达。左边的数字表示分子量（kDa），n=3。（B-D）PC沉默导致PEP积累并促进乳酸代谢。（B-C）PEP或乳酸的总水平和（D）13乳酸的C同位素分布。（E-F）PCK1促进葡萄糖利用。131,6-二磷酸果糖和磷酸二羟丙酮（DHAP）的C同位素分布13C类6-葡萄糖作为示踪剂。（G） PCK1过表达增加AMP/ATP比率。总AMP/ATP比率。（H-J）PCK1过表达可恢复细胞中的代谢产物比率。代谢产物比率13C同位素或总代谢物水平。Asp=天冬氨酸；PEP=磷酸烯醇丙酮酸盐；1,3BPG=1,3二磷酸甘油酯；pyr=丙酮酸。（K-N）PCK1在HEK293T细胞中可能发生反向反应。13天冬氨酸和苹果酸的C同位素分布13C类6-葡萄糖或13C类三-丙酮酸作为示踪剂。（O-Q）PCK1过度表达抑制戊糖磷酸途径（PPP）。13核糖5-磷酸、7-磷酸己酮果糖和1,7二磷酸己酮酮果糖的C同位素分布13C类6-葡萄糖作为示踪剂。在（B-Q）中，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001；***，p<0.0001，n=3。统计差异指的是对照组（对照组对siPC，对照组对PCK1 OE）。仅显示了正文中强调的siPC和PCK1 OE条件之间的比较。
图5。
图5 PCK1是SIRT1基板在体外和体外试验。
（A） SIRT1脱乙酰PCK1在体外PCK1从暴露于不同葡萄糖浓度的HEK293T细胞中纯化，并用重组SIRT1或SIRT2脱乙酰酶处理。（B） SIRT1过度表达降低PCK1乙酰化水平。PCK1和SIRT1野生型或SIRT1 H363Y非活性突变体在HEK293T中共同表达。PCK1从HEK293T裂解物中免疫沉淀，并使用抗乙酰赖氨酸（AcK）抗体进行检测，n=3。（C） SIRT1沉默增加了HEK293T和HepG2细胞中PCK1乙酰化。SIRT1（siSIRT1）和SIRT2（siSIRT1）在两种糖异生细胞系中均沉默，使用镍树脂拉下PCK1，并使用抗乙酰赖氨酸（AcK）抗体n=2进行探测（另见图S4A）。（D） 从（C）中获得的PCK1乙酰化相对水平的量化。平均值±标准偏差，n=2。（E） 静默SIRT1会修改PCK1活动。从（C）中获得的PCK1的活性在两个反应方向上都进行了测定。白色条=从正常表达SIRT1的细胞中获得的PCK1。黑条=从SIRT1敲除细胞纯化的PCK1。平均值±标准偏差，n=2，**p<0.01。（F） 野生型PCK1的表达水平（SIRT1+/+)和SIRT1 KO（SIRT1−/−)组织，n=3。（G） 在两个反应方向上测量从（F）动物中纯化的PCK1的活性（见图S4B和表S4）。平均值±标准偏差，n=3，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。（H） 从野生型（SIRT1）纯化的PCK1的Michaelis-Menten比较图+/+)和SIRT1 KO（SIRT1−/−)政治公众人物和国内生产总值的组织。平均值±标准偏差，n=3（见表S4）。（一） SIRT1是小鼠体内的PCK1脱乙酰酶。western blotting法测定从（F）纯化的PCK1的乙酰化水平。
图6。
图6 GSK3β介导的磷酸化控制PCK1稳定性并促进SIRT1依赖性脱乙酰化。
（A） SIRT1部分脱乙酰重组PCK1 K91AcK在体外在2 mM NAD存在下+.在不存在（K91AcK）或存在SIRT1（K91阿克+SIRT1）或SIRT2（K91AcK+SIRT2）的情况下的相对乙酰化水平。平均值±标准差，n=3，**p<0.01。（B） 从暴露于低（LG；2.5 mM）或高糖（HG；25 mM）培养基的HEK293T细胞中提取PCK1（α-HA），并使用测定其磷酸化和乙酰化。右侧的图表表示平均值±SD，n=3。（C） AMPK和GSK3抑制影响PCK1磷酸化和乙酰化。用不同的激酶抑制剂处理过表达PCK1（α-HA）的HEK293T细胞。取下PCK1并分析其乙酰化和磷酸化水平（见图S5、S5B和S5C）。（D） 沉默GSK3β可降低PCK1磷酸化和泛素化，并增加其乙酰化。在过度表达PCK1（α-HA）的细胞中，内源性GSK3β沉默（siGSK3？）。取PCK1进行western blot分析，n=2。（E） GSK3β的过度表达增加了HEK293T和HepG2细胞中PCK1磷酸化（α-pSer/Thr）和泛素化（α-Ub），并降低了乙酰化（α-AcK）。将PCK1（α-HA）拉下来，并针对不同的PTM进行探测，n=2（另请参见图S5D和S5E）。（F） S90A取代降低PCK1的磷酸化（α-pSer/Thr）和泛素化（α-Ub），并增加乙酰化（α-AcK）。测定了下拉PCK1野生型（WT）、PCK1 S90A（S90A）和PCK1 T92A（T92A）的磷酸化和乙酰化，n=3，（另见图S5F）。（G） S90A取代增加PCK1半衰期。用环己酰亚胺处理过表达PCK1野生型（WT）或PCK1 S90A（S90A）的HEK293T，并在不同时间点收获，平均值±SD，n=2，*p<0.05。（H） 在GSK3β存在下，PCK1 S90A水平保持不变。PCK1 WT或S90A（α-HA）突变体在存在或不存在过表达GSK3β（α-myc）的情况下独立表达，n=2。（一） S90A取代降低PCK1的糖原生成能力。在HEK293T中测定了PCK1（WT）或PCK1 S90A（S90A）（α-HA）的糖异生能力。*p<0.05，n=3。（J） S90A取代促进HEK293T细胞中的葡萄糖摄取。测定模拟转染细胞（对照）和过度表达PCK1（WT）或PCK1 S90A（S90A）的细胞的葡萄糖摄取率**p<0.01，n=4，n.s.=不显著。在I-J中，代表性的蛋白质印迹显示在每个图的下方。（K） PCK1 S90E+K91AcK通过SIRT1脱乙酰在体外存在0.5 mM NAD时+（见图S5G、S5H和S5I）。
图7。
图7乙酰化、磷酸化和泛素化在调节PCK1活性中的作用示意图。
图示为糖酵解（红色箭头）和糖异生（蓝色箭头）途径。SIRT1=Sirtuin 1；PCK1=胞浆磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；MDH1/2=细胞溶质/线粒体苹果酸脱氢酶；PK=丙酮酸激酶；PDH=丙酮酸脱氢酶复合物；p300=乙酰转移酶p300。表示乙酰化（Ac）、磷酸化（P）和泛素化（Ub）。
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