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.2018年6月；20(6):677-687.
doi:10.1038/s41556-018-0108-1。 Epub 2018年5月21日。

Notch1表达细胞的克隆分析揭示了胚胎乳腺中存在具有长期可塑性的单能干细胞

安娜·M·莉亚 1 2, 维罗妮卡·罗迪拉 三 4 5, 马蒂尔德·惠格 1 2, 爱德华·汉内佐 6 7 8 9, 卡米尔·兰拉金 1 2, 奥利维尔·雷诺 1 2 10, 奥利维尔·勒罗伊 1 2 10, 斯特芬·鲁兰（Steffen Rulands） 11 12, 本杰明·D·西蒙斯 6 7 8, 西尔维娅·弗雷 13 14
附属公司

Notch1表达细胞的克隆分析揭示了胚胎乳腺中存在具有长期可塑性的单能干细胞

安娜·M·莉亚等。 Nat细胞生物学. 2018年6月.

摘要

最近的血统追踪研究表明，乳腺内环境稳定依赖于单能干细胞。然而，在胚胎乳腺发育过程中是否以及何时发生谱系限制，以及哪些信号协调了细胞命运的规范，仍然未知。通过结合体内克隆分析、整体免疫荧光和克隆动力学的数学模型，我们发现胚胎多能干乳腺细胞在发育的早期就意外地受到了谱系限制，有证据表明早在E12.5时就具有单一性，E15.5后就没有统计上可辨别的双能性。为了深入了解从多能性到单能性转换的机制，我们使用功能增强型Notch1小鼠，并证明Notch激活细胞自主决定胚胎和基底细胞的腔细胞命运规范。这些功能研究对于理解细胞可塑性的信号具有重要意义，并有助于阐明胚胎程序在成年细胞中的重新激活如何导致癌症。

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数字

图1
图1。胚胎乳腺芽共同表达管腔和基底标记。
三苯氧胺在E13.5诱导N1Cre/mTmG胚胎乳腺胚芽的代表性切片（a、b、c、上面板、d、e），或E15.5处（c下面板）24小时后通过苏木精染色进行分析（a）; 使用抗ERα抗体进行免疫染色（在b条); 管腔标记物K8的免疫荧光（红色，c和d，上部面板)和基础标记K14（白色c（c）中的红色e、 上部面板); K5（红色，d中的底部面板); 和p63（红色，e中的下面板). GFP公司销售时点情报系统绿色的细胞代表N1C标记的胚胎细胞b至e.DAPI将细胞核染色为蓝色c、 e（电子）。每种颜色的分割通道显示在c-d。3个个体胚胎在E13.5诱导，3个个体胚在E15.5诱导。比例尺对应20μm inb至e，放大倍数为10μmc-e公司.
图2
图2。在出生时就规定了内脏和基础的特性。
a-b类。GFP内管腔（LC）和基底细胞（BC）门控的典型FACS点图销售时点情报系统N1Cre/mTmG中的人口（a）或SMACre/mTmG（b）E13.5诱导三苯氧胺6周后的小鼠（a）或P3（a-b）在中量化c（c）和d日.c-d。GFP的FACS量化销售时点情报系统BC（绿色）与N1Cre/mTmG中乳腺上皮细胞（MEC，橙色）内BC的比例（c）或SMACre/mTmG（d）小鼠，在三苯氧胺诱导6周后的指定发育时间；n=5、4、5、3和6只分别在E13.5、E15.5、E17.5、P0.5（MEC:19.01±2.27，GFP:95.45±2.26）和P3（MEC:25.67±1.37和GFP:99.56±0.06）诱导的N1Cre/mTmG独立小鼠；n=7只和2只分别在P0.5和P3诱导的SMACre/mTmG生物独立动物。Notch1-Cre的示意图ERT2系统和SMA-芯ERT2系统(学报2-克里ERT2系统)传给Rosa26毫微克每个图表上方都显示了老鼠。电子表格。N1Cre/mTmG中K5（红色）免疫荧光染色分析乳腺导管的代表性切片（e）和SMACre/mTmG（f）小鼠在P3诱导三苯氧胺6周后。源自Notch1的世系销售时点情报系统或SMA销售时点情报系统细胞以绿色的膜结合GFP标记；每行2只老鼠。比例尺对应20μm in电子频率插图中为10μm。图表显示平均值±SEM。p=0.000006英寸（c）P0.5和P3的p分别为0.00000000002和0.0003（d），使用双尾非配对威尔士t检验。***p<0.001。补充表1中提供了源数据。
图3
图3。Notch1pos胚胎乳腺细胞具有单能细胞命运潜能。
a-b类。用0.05 mg或0.1 mg三苯氧胺在E15.5诱导的N1Cre/Cwatti小鼠乳腺树的单个Z堆叠整体免疫染色，分析48小时（a）2周后（b）K5（白色）标记基底细胞的免疫染色。GFP（绿色）、青色（蓝色）、YFP（黄色）、RFP（红色）标记Notch1衍生世系，被视为从一个ESC衍生的唯一克隆；30个胚胎的98个腺体和21只小鼠65个腺体的139个克隆。图像采集为不同的瓷砖，没有重叠，并将其缝合在一起。中的虚线（b）标定缝合线。c。示意图说明了如何将单能细胞（红细胞，“偶然双能”）的两个独立标记事件与多能干细胞（红血球，“真正双能性”）的独特标记混淆。d。在指定的胚胎期用三苯氧胺诱导的1-2周龄N1Cre/Cwatti小鼠中，与实验评分的双极性（灰色）相比，理论双极性几率（红色）的百分比。n=在E12.5、E13.5、E15.5、E17.5诱导的8、5、5、3只独立动物。p值=p<0.0001，p<0.000，p=0.5，p=0.43。在每个时间点调整三苯氧胺的剂量，以达到可比较的重组效率，用绒毛颜色/腺体的平均数量表示（见方法）。e、。48小时后（短追，黑色）或P7（长追，棕色）分析在指定时间点诱导的小鼠的平均颜色/腺体数，以及指定剂量。重组效率（短追踪）反映了每剂量他莫昔芬在P7（长追踪）处发现的颜色数量（差异不显著）。短时间内n=22、32、13、14、14个独立乳腺，长时间追逐n=14、9、11、10、16个独立乳腺。f、。短追逐后得分的诱导克隆事件数量与长追逐估计的推断克隆事件数量。n=12,9,8只在E13.5全剂量（黑点）、E15.5稀释剂量（红点）和E15.5全剂量（蓝点）诱导的生物独立动物。采用双尾二项检验评估各组之间的统计差异。图表显示了平均值±SEM。补充表1中的源数据。放大倍数中的比例尺为100μm或50μm（a），100μm英寸（b）.
图4
图4。胚胎中的Notch1激活将多能干细胞锁定为管腔单能细胞命运。
交流。N1Cre/mTmG的代表性截面(a、 c（c）)和N1Cre/N1ICD(b、 c（c）)在E13.5诱导，48小时后通过免疫荧光染色对基础标记K14（白色）、管腔标记K8（红色）和抗GFP（绿色）进行分析(a、 b条)或苏木精染色(c（c）). 在N1Cre/mTmG模型中，Notch1衍生谱系被膜结合GFP标记为绿色(一)N1Cre/N1ICD小鼠的核GFP(b条). DAPI将细胞核染成蓝色a、 b条; 每个基因型2个胚胎。面板上方显示了N1Cre/mTmG和N1Cre/N1ICD小鼠的示意图一和b条分别是。d。GFP内管腔（LC）和基底细胞（BC）的典型FACS点图销售时点情报系统N1Cre/N1ICD小鼠在E13.5诱导6周后的群体；n=4只小鼠。e、。FACS量化MEC（橙色）或GFP内BC的百分比销售时点情报系统在指定的发育时间用三苯氧胺诱导N1Cre/N1ICD小鼠的细胞（绿色），并在6周追踪后进行分析；n=4、6、8和5只分别在E13.5、E15.5、P0.5和P3诱导的生物独立动物。橙色圆点代表所有分析小鼠的MEC群体（n=23）。采用Mann-Whitney检验计算p值：分别为p=0.0001、p<0.0001、p<00001和p<000001。f-g。N1Cre/mTmG的代表性截面(（f）)和N1Cre/N1ICD(克)在E13.5诱导，6周后通过免疫荧光染色对基础标记SMA（红色）和抗GFP（绿色）进行分析。在N1Cre/mTmG模型中，Notch1衍生谱系被膜结合GFP标记为绿色(（f）)以及N1Cre/N1ICD中的核GFP(克)老鼠。DAPI染色细胞核呈蓝色；分别为5只和4只小鼠。比例尺对应20μm或10μm（放大倍数）。图表显示平均值±SEM。***p<0.001。补充表1中提供了源数据。
图5
图5。Notch1决定管腔ERα阴性细胞的命运。
a。总管腔细胞（LC门控）或GFP中CD133和Sca1表达的典型FACS点图销售时点情报系统在E13.5的他莫昔芬诱导后6周，2只独立小鼠的N1Cre/N1CD小鼠中的LC（GFP门控）。b。FACS数据量化显示管腔细胞百分比（LC）或在指定时间用三苯氧胺诱导N1Cre/N1ICD小鼠进行6周追踪后，N1ICD表达细胞（GFP）呈现Sca1（紫色）或CD133（蓝色）表达。N=2、6、8和5只分别在E13.5、E15.5、P0.5和P3诱导的生物独立动物；在LC图中，n=21。图表显示了平均值±SEM：Sca-1的5.7±2.6，CD133的9.9±3.2（E13.5），Sca-1和CD133（E15.5）的1.7±0.3和6.5±1.4，Sca-1和CD1313的2.8±0.8和5.4±0.9（P0.5），Sca-1的0.9±0.2和CD133（P3）的7.6±1.3。p=***p<0.001，使用双尾非配对威尔士t检验。c-d公司N1Cre/mTmG的代表性截面(c（c）)和N1Cre/N1ICD(d日)小鼠在E13.5诱导，48小时后通过免疫荧光染色对腔标记物K8（红色）和增殖标记物Ki67（白色）进行分析。在N1Cre/mTmG模型（c）和N1Cre/N1ICD（d）小鼠中，通过膜结合GFP和核GFP将Notch1衍生谱系标记为绿色。DAPI染色细胞核呈蓝色；2只生物独立的动物。e、。说明Notch1激活（N1Cre/N1ICD）如何施加管腔ERα的示意图否定细胞对胚胎细胞的命运（E13.5），否则将产生所有乳腺细胞类型（N1Cre/mTmG）。补充表1中提供了源数据。
图6
图6。异位Notch1激活改变了乳腺细胞的命运。
a。代表性FACS图和GFP中BC百分比的量化销售时点情报系统在P21诱导的SMACre/mTmG（左侧组，n=4只生物独立动物）或SMACre/N1ICD（右侧组）的种群，并在3周（n=5只小鼠）或6周（n=3只小鼠）后进行分析。图中显示了平均值±SEM:51.3±10.5（3w机箱）和2.6±1.0（6w机箱）。使用双尾非配对威尔士t检验计算P值：P=0.0189和P<0.0001。b。Sca1的点图销售时点情报系统/CD133型销售时点情报系统总LC（红色）和GFP中的细胞销售时点情报系统SMACre/N1ICD小鼠的细胞（绿色）（P21+6周追踪）；n=4只生物独立的动物。c。在P21诱导K5Cre/N1ICD的代表性FACS图，并在3周或6周后进行分析；n=3只独立动物。d。SMACre/mTmG乳腺导管的代表性石蜡切片（左面板）或SMACre/N1ICD（中面板）或K5Cre/N1ICC（右面板）雌性腺体的冷冻切片（P21用三苯氧胺诱导），6周后用抗SMA（红色）或抗K8（紫色）抗体进行免疫荧光染色分析。SMACre/mTmG模型中的膜结合GFP和SMACre/N1ICD小鼠中的核GFP以绿色标记SMA衍生谱系；4种生物独立动物。比例尺对应20μm。e、。说明基底细胞（SMACre/N1ICD或K5Cre/N1ICD）中异位Notch1激活如何影响管腔ERα的示意图否定细胞甚至对已经分化的基底细胞的命运***p<0.001和*p<0.05。补充表1中提供了源数据。
图7
图7。Notch1激活诱导的基底-腔转换的转录组学分析。
a。Notch1相关基因的热图，使用GFP每个重复3次的平均表达值的对数（fpkm）否定和GFP销售时点情报系统细胞。b。超过五次Log2折叠更改的成绩单（FC）GFPneg和GFP的RNA-seq获得的差异销售时点情报系统TAM诱导72h后SMA/N1ICD小鼠分选细胞；蓝色条对应过度表达的转录物，绿色条表示下调的转录物。c。Notch激活后，顶级基因中过度表达的GO类别显著下调。d。基因集富集分析（GSEA）显示Notch激活时表达的基因之间的反向相关性（GFP销售时点情报系统细胞）与“Mammary_Stem_Cell_Up”的GO签名进行比较。根据对数2倍的变化，对来自三个重复的12984个基因进行了预先排序。e、。胚胎乳腺发育分化层次模型。多功能乳腺干细胞存在于早期乳腺板中，但在E12.5时开始出现一些谱系限制，因为可以在大约30-40%的频率下发现单一功能管腔或基底前体，而其余的MaSC仍然是多功能的。从胚胎期E15.5开始，未观察到统计上可辨别的多向分化，这表明乳腺的产前生长和分支是由单能管腔或基底祖细胞支持的。在P0，额外程度的命运限制建立了两个独立持续的管腔谱系，ER销售时点情报系统和ER否定管腔细胞。Notch信号阻止乳腺胚胎发生期间基础前体的生成并阻断内质网销售时点情报系统细胞命运规范。
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中的注释

  • 乳房发育中的血统限制。
    Bland P，霍华德文学学士。 Bland P等人。 自然细胞生物学。2018年6月；20(6):637-639. doi:10.1038/s41556-018-0111-6。 自然细胞生物学。2018 PMID：29784916 没有可用的摘要。

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