CARF enrichment promotes epithelial-mesenchymal transition via Wnt/β-catenin signaling: its clinical relevance and potential as a therapeutic target

doi:10.1038/s41389-018-0048-4

.2018年5月11日；7(5):39.

doi:10.1038/s41389-018-0048-4。

CARF富集通过Wnt/β-catenin信号促进上皮间质转化：其临床相关性和作为治疗靶点的潜力

拉吉库马尔·S·卡拉¹, Anupama Chaudhary公司¹, A-Rum Yoon公司², 普里扬舒·巴加瓦¹, 阿穆尔·奥马尔¹, 苏坎·加格¹, 蔡玉云^三, 苏尼尔·考尔⁴, 雷努·瓦德瓦⁵

附属公司

¹药物发现和资产创新实验室，DBT-AIST高级生物医学国际实验室（DAILAB），日本茨城筑波，日本高级工业科学技术研究所（AIST），日本，305-8565。
²汉阳大学工程学院生物工程系，韩国首尔Seongdong-gu。
^三汉阳大学工程学院生物工程系，韩国首尔Seongdong-gu。chaeok@hanyang.ac.kr。
⁴药物发现和资产创新实验室，DBT-AIST国际先进生物医学实验室（DAILAB），DAICENTER，国家先进工业科学技术研究所（AIST），日本茨城筑波，305-8565。s-kaul@aist.go.jp。
⁵药物发现和资产创新实验室，DBT-AIST国际先进生物医学实验室（DAILAB），DAICENTER，国家先进工业科学技术研究所（AIST），日本茨城筑波，305-8565。renu-wadhwa@aist.go.jp。

PMID： 29748568
预防性维修识别码：项目编号：5945778
内政部： 10.1038/s41389-018-0048-4

CARF富集通过Wnt/β-catenin信号促进上皮间质转化：其临床相关性和作为治疗靶点的潜力

拉吉库马尔·S·卡拉等。肿瘤发生. 2018.

.2018年5月11日；7(5):39.

doi:10.1038/s41389-018-0048-4。

作者

附属公司

¹药物发现和资产创新实验室，DBT-AIST国际先进生物医学实验室（DAILAB），DAICENTER，国家先进工业科学技术研究所（AIST），日本茨城筑波，305-8565。
²汉阳大学工程学院生物工程系，韩国首尔Seongdong-gu。
^三汉阳大学工程学院生物工程系，韩国首尔Seongdong-gu。chaeok@hanyang.ac.kr。
⁴药物发现和资产创新实验室，DBT-AIST高级生物医学国际实验室（DAILAB），日本茨城筑波，日本高级工业科学技术研究所（AIST），日本，305-8565。s-kaul@aist.go.jp。
⁵药物发现和资产创新实验室，DBT-AIST高级生物医学国际实验室（DAILAB），日本茨城筑波，高级工业科学技术研究所（AIST），日本，305-8565。renu-wadhwa@aist.go.jp。

PMID： 29748568
预防性维修识别码：项目编号：5945778
内政部： 10.1038/s41389-018-0048-4

摘要

CARF（ARF的合作者）/CDKN2AIP被发现是一种新的ARF结合蛋白。它已被确定为一种基本的细胞生存、p53和细胞增殖调节蛋白。尽管CARF的适度上调会导致生长停滞和衰老，但其过度富集水平会促进癌细胞的侵袭性增殖和恶性转化。在这里，我们检查了临床肿瘤中CARF水平的相关性，并发现其在多种侵袭性和转移性恶性肿瘤中的扩增（基因和转录水平）。与临床结果一致，癌细胞中CARF的富集促进了上皮-间充质转化（EMT）。癌症数据库和分子分析表明，它激活Wnt/β-catenin信号轴，这一点可以通过增强核定位和β-catentin功能来证明，其标志是SNAIL1、SNAIL2、ZEB1和TWIST1及其下游基因靶点水平的增加。值得注意的是，CARF的靶向敲除导致参与EMT进展的核β-catenin及其关键下游效应器的减少。与此相一致，CARF体内靶向裸siRNA或携带腺病毒的CARF shRNA可抑制肿瘤进展和肺转移。总之，我们报告了CARF在EMT和癌症侵袭/转移中的临床和治疗相关性，并建议将其作为侵袭性癌症的有效治疗靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

**图1。CARF扩增及其在转移性恶性肿瘤中的富集。**
一TCGA数据库中临床癌症数据集的CARF扩增百分比。b条侵袭性和转移性恶性肿瘤CARF mRNA水平的富集；RNA-Seq（V2算法）表达式，单位为log10。**c（c）**转移性乳腺癌细胞系中CARF基因扩增（上）；值表示为褶皱富集（下部）。d日显示以下患者候选基因（TCGA定义的侵袭/转移和血管生成基因集中的短名单）扩增百分比的点图(n个 = 10）和没有(n个 = 97）NEPC（2016）数据集中的CARF扩增

**图2。CARF富集与临床肿瘤的转移进展相关。**
一免疫组织化学染色显示CARF在正常、浸润性和转移性乳腺癌患者肿瘤中的表达；它们的数量水平如右图所示。b条、不同年龄组正常乳腺癌至浸润性乳腺癌（亚组#1）和浸润性乳腺肿瘤至转移性乳腺癌患者（亚组#2）的CARF水平；定量如下所示。**c（c）**CARF在肠、肝和皮肤正常和转移性肿瘤组织中的表达；定量如右图所示。d日正常和恶性乳腺、前列腺、皮肤、肝脏和肾脏肿瘤切片中CARF表达的定量；以及从人类蛋白质图谱中检索到的正常、小叶和导管乳腺癌的免疫组织学切片(**e（电子）**)

**图3。CARF的富集增强了癌细胞的迁移和侵袭性。**
一显示癌细胞系中CARF的比较蛋白表达的定量。b条感染对照/pCXNeo载体和CARF-GFP逆转录病毒的U2OS细胞的细胞形态，放大×10和×40倍。免疫印迹和qPCR数据显示CARF蛋白和转录表达稳定细胞如下所示。**c（c）**Matrigel侵入分析显示对照组和CARF-GFP细胞的侵入细胞（顶部为微孔）和计数（插图，下图）；定量如右图所示。d日伤口愈合试验（72小时）显示对照细胞和CARF富集细胞的相对迁移，定量如下所示。**e（电子）**免疫印迹显示CARF-GFP细胞中间充质（n-cadherin、fibronectin、kinesin和vimentin）和侵袭性（MMP2、MMP9、hnRNP-K和uPA）标记物的表达增加。**（f）**波形蛋白、N-钙粘蛋白和纤维连接蛋白的免疫染色显示它们在CARF-GFP细胞中的表达增加，其荧光强度的定量如右图所示。mRNA水平定量显示侵袭性增加(克; MMP1、MMP3和MMP8）和上皮细胞减少(小时; 与对照细胞相比，CARF-GFP细胞中分别存在CK8、CK14和CK18）标记

图4
**CARF富集通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进EMT。** 一免疫染色显示β-catenin在对照细胞和CARF富集细胞中的表达；右图中的β-catenin核富集在后者中清晰可见（×100，用箭头标记）。b条对照细胞和富含CARF的细胞中转录因子（SNAIL1、SNAIL2、ZEB1、TWIST1和CDH1）的mRNA表达。**c（c）**β-catenin靶基因（WNT1、CTNBB1、DVL2、AXIN2、TCF4和LEF1）的转录水平；定量（折叠变化）如右图所示。d日基于qPCR的mRNA定量显示CARF富集细胞中Wnt3α增加。**e（电子）**免疫染色显示survivin表达。**（f）**免疫印迹显示CARF-GFP细胞中β-catenin及其靶蛋白survivin、cyclin D1和SMAD2/3增加。克TCF-β1和SMAD2/3免疫染色显示后者增加，定量如右图所示。小时免疫印迹显示对照组、IWP2-、PP-和iCRT14-治疗对照组（U2OS pCXNeo）和CARF富集细胞（CARF-GFP）中β-catenin及其靶点（Survivin、Cyclin D1）的蛋白质水平，定量如右图所示。我IWP2-和PP处理细胞的β-连环蛋白免疫荧光；在PP处理的细胞中观察到核β-连环蛋白缺乏

**图5。CARF敲除减弱了癌细胞的侵袭性并消除了EMT表型。**
一对照组和CARF siRNA转染的结晶紫染色SKOV-3细胞显示，随着siRNA（10-200 pM）浓度的增加，后者的增殖减少。CARF免疫染色（50 pM siRNA）和细胞存活率（10-200 pM）。b条显示侵入细胞的侵入分析以及对照和CARF敲低细胞中的定量（如下）。**c（c）**伤口愈合试验（72小时）显示CARF击倒细胞中细胞迁移减少；定量如下所示。d日免疫印迹和**e–g**CARF、β-catenin的免疫染色(**e（电子）**)，E-钙粘蛋白和波形蛋白(**（f）**)以及纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白(克)CARF敲除细胞减少；E-钙粘蛋白增加；其荧光强度的定量如下所示

**图6。CARF基因敲除通过消除β-catenin核转位减少EMT进展。**
一免疫染色显示CARF击倒细胞细胞核中β-catenin表达缺失；总量及其核水平的定量如右图所示。b条Wnt1免疫染色显示SKOV-3和U2OS CARF受损细胞的核病灶减少。**c（c）**Survivin和Cyclin D1免疫染色显示其在SKOV-3 CARF/siRNA细胞中的水平降低。d日c-Myc免疫染色显示其在CARF击倒SKOV-3和U2OS细胞中的表达降低。**e（电子）**SNAIL1、SNAIL2、ZEB1、TWIST1和ACTA2（αSMA）的转录水平，以及**（f）**β-catenin靶基因；WNT1、CTNBB1、DVL2、AXIN2、TCF4和LEF1在CARF敲除细胞中表达减少；褶皱变化的定量如右图所示。克免疫印迹显示SKOV-3 siCARF细胞中β-catenin及其效应蛋白即Wnt1、survivin和SMAD2/3减少。小时免疫染色显示SKOV-3 siCARF细胞SMAD2/3核定位降低；右侧显示了带有半透明核（蓝色）的交互式IMARIS图像

**图7。CARF敲除可减轻异种移植模型中的肿瘤转移。**
一显示裸鼠异种移植试验方案的示意图。b条对照、富含CARF和CARF受损的异种移植物的肿瘤体积。**c（c）**PBS、RdB或RdB-shCARF系统治疗小鼠原位异种移植瘤的荧光素酶活性；荧光素酶强度及其刻度条显示在右侧。d日定量图显示在第7、14和21天从PBS、RdB或RdB-shCARF组检索到的总流量（p/s）值（肿瘤大小）。**e（电子）**示意图模型显示了CARF在EMT进展中的作用，它刺激β-连环蛋白的核定位，从而激活促进EMT进展的几个关键转录因子和基因靶点

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1. Lamouille S，Xu J，Derynk R.上皮-间充质转化的分子机制。摩尔细胞生物学国家版。2014;15:178–196. doi:10.1038/nrm3758。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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