A drug combination targeting hypoxia induced chemoresistance and stemness in glioma cells

doi:10.18632/oncotarget.24839

。2018年4月6日；9(26):18351-18366.

doi:10.18632/目标24839。

靶向缺氧诱导的胶质瘤细胞化疗耐药和干细胞的药物组合

阿坎沙·贾洛塔^1 2, 穆克什·库马尔¹, Bhudev C Das公司^三 4, 亚杰·K·雅达夫^三, Kunzang Chosdol公司², Subrata Sinha公司^1 2

附属公司

¹印度古尔冈市马尼萨尔国家大脑研究中心，邮编：122051。
²全印度医学科学研究所生物化学系，新德里-110029，印度。
^三印度德里大学生物医学研究中心B.R.Ambedkar博士，德里-110007。
⁴阿米蒂大学阿米蒂分子医学和干细胞研究所，印度诺伊达-2013。

PMID： 29719610
预防性维修识别码：项目经理5915077
内政部： 10.18632/目标24839

靶向缺氧诱导的胶质瘤细胞化疗耐药和干细胞的药物组合

阿坎沙·贾洛塔等。肿瘤靶点。 2018。

。2018年4月6日；9(26):18351-18366.

doi:10.18632/目标24839。

作者

阿坎沙·贾洛塔^1 2, 穆克什·库马尔¹, Bhudev C Das公司^三 4, 亚杰·K·雅达夫^三, Kunzang Chosdol公司², Subrata Sinha公司^1 2

附属公司

¹印度古尔冈市马尼萨尔国家大脑研究中心，邮编：122051。
²全印度医学科学研究所生物化学系，新德里-110029，印度。
^三印度德里大学生物医学研究中心B.R.Ambedkar博士，德里-110007。
⁴印度诺伊达阿米蒂大学阿米蒂分子医学和干细胞研究所，邮编：201313。

PMID： 29719610
预防性维修识别码：项目经理5915077
内政部： 10.18632/目标24839

摘要

缺氧是实体瘤尤其是胶质母细胞瘤的特征，对化疗耐药至关重要。众所周知，缺氧小生境中的肿瘤干细胞是肿瘤进展、转移和复发的主要原因。我们试图确定对肿瘤细胞和肿瘤干细胞的缺氧和常氧有效的协同药物组合。由于COX-2在胶质母细胞瘤亚群中过度表达，并且在缺氧时也会被诱导，因此我们研究了原型环氧合酶（COX-2）抑制剂NS-398与各种药物（BCNU、替莫唑米、2-脱氧-D-葡萄糖和顺铂）的组合，以了解它们在两种严重缺氧（0.2%O）下消除化疗耐药性的能力₂)和常氧（20%O₂)在胶质瘤细胞中。唯一有效的联合药物是NS-398和BCNU，两者在缺氧和常压下均表现出协同作用。这种协同作用在亚致死剂量下对任何一种单一药物都是明显的。联合用药的有效性是由于促凋亡分子增加、抗凋亡分子减少以及caspase活性增加所致。前列腺素E₂在缺氧期间，COX-2活性的一种表现是水平升高，但在缺氧和常氧期间联合使用会降低。联合用药降低了上皮-间充质转化（EMT）标记物的水平。这也导致了细胞迁移的大幅减少。虽然单一药物可以减少胶质瘤球的数量，但联合用药成功地消除了它们的形成。这种联合还导致癌症干细胞标记物CD133的显著降低。这种结合可能是一种治疗高度缺氧类胶质瘤的原型。

关键词：BCNU；COX-2抑制剂；第2页；化学增敏；缺氧。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者没有透露潜在的利益冲突。

数字

**图1。胶质瘤细胞系中COX-2的表达**
(A类)mRNA水平的表达。COX-2在LN229和U87MG细胞系中表达，在低氧条件下LN229中表达上调（9倍变化，第页<0.001）和U87MG细胞系（2.2倍变化，第页< 0.01). (B类)蛋白质水平表达。COX-2蛋白在LN229和U87MG细胞中表达，在低氧条件下，LN229（1.9倍变化）和U87MG（1.3倍变化）细胞中表达上调。车道N表示常氧控制，车道H表示缺氧控制。以β-actin为对照。总的来说，缺氧期间COX-2 mRNA和蛋白表达增加。

图2
(我)不同剂量BCNU和NS-398的细胞活力分析。两种细胞系均用增加浓度的BCNU和NS-398处理，并用MTT法评估细胞活力。在缺氧和常氧条件下，在（A，C）LN229和（B，D）U87MG细胞系中观察到BCNU和NS-398的剂量依赖性细胞毒性。结果表示为三个实验重复的平均值±SD。在所有条件下，个别药物的药物效应在缺氧条件下都会降低。(**ii（ii）**)联合用药（BCNU+NS-398）后的细胞活力分析。用BCNU、NS-398和BCNU+NS-398处理细胞，并在处理72小时后通过MTT分析评估细胞活力。BCNU+NS-398（75μM的BCNU和200μM的NS-398）在缺氧和常压下对两种细胞株（A，B）LN229和（C，D）U87MG细胞株表现出协同作用（CI<0.9）。结果表示为三个实验重复的平均值±SD。联合用药比单一用药效果更好。这对正常氧来说是真的(第页BCNU和第页与NS-398相比<0.01）以及缺氧(第页BCNU和第页NS-398为<0.01）。此外，对于U87MG，正常氧的显著水平为第页BCNU和第页NS-398小于0.05。对于缺氧，显著水平为第页BCNU和第页NS-398小于0.05。

**图3。药物治疗后胶质瘤细胞PI和Annexin V染色**
(我)LN229和(**ii（ii）**)在常氧和缺氧24小时后，用药物（BCNU、NS-398和联合用药）处理U87MG细胞，并在整个实验中保持相同的状态。药物治疗48小时后进行PI和Annexin V染色。我们观察到，与单一药物（BCNU或NS-398）相比，联合用药（BCNU+NS-388）诱导的早期凋亡明显增加。早期凋亡表现为Annexin V阳性和PI阴性细胞。染色细胞的百分比显示在每个图的下方。

图4
(我)药物诱导的Caspase 3/7活性和Caspase抑制剂的作用。用BCNU、NS-398和BCNU+NS-398处理细胞，48小时后评估caspase 3/7活性。在（A）LN229和（B）U87MG细胞系中，与单一药物相比，BCNU和NS-398组合在低氧和常氧条件下的Caspase 3/7活性上调。添加caspase抑制剂可降低药物诱导的caspase活性。结果表示为三个实验重复的平均值±SD。(**ii（ii）**)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂处理后的细胞活力分析。在存在和不存在caspase抑制剂的情况下，用BCNU、NS-398和BCNU+NS-398处理两种细胞系，72小时后进行MTT检测。在（A）LN229和（B）U87MG细胞系中，半胱天冬酶抑制剂能够通过单一药物和联合药物逆转细胞活力的下降。总的来说，结果表明caspase 3/7活性在决定药物联合诱导的细胞活性降低中的作用。

图5
(我,**ii（ii）**)促凋亡和抗凋亡标记在不同条件下的表达。该图显示了实时PCR检测的促凋亡标记（Bax、细胞色素c和caspase 3）和抗凋亡标记（Bcl2）的定量mRNA表达。在（i）LN229和（ii）U87MG细胞系中，与单一药物相比，在缺氧和常压条件下，联合用药可使促凋亡标记物上调，抗凋亡标记物下调。结果表示为三个实验重复的平均值±SD。(三)LN229细胞系中Bcl2和Bax的Western blot分析。我们还研究了LN229细胞系中Bcl2和Bax的蛋白质水平。在常氧和缺氧条件下，与单一药物相比，联合用药上调Bax，下调Bcl2。车道C表示控制，车道B表示BCNU，车道N表示NS-398，车道（B+N）表示BCNU+NS-398。

**图6。相对PGE₂不同条件下指示COX-2活性的浓度**
对低氧和常压下经药物处理的LN229和U87MG细胞系的培养上清液（BCNU、NS-398和BCNU+NS-398）和对照样品进行PGE检测₂通过EIA试剂盒进行浓缩。在缺氧和常氧条件下，用组合（BCNU+NS-398）处理的细胞中的相对PGE2浓度显著降低(A类)LN229和(B类)U87MG细胞系。结果表示为三个实验重复的平均值±SD。联合用药比单一用药效果更好。这对正常氧来说是真的(第页BCNU和第页与NS-398相比<0.05）以及缺氧(第页BCNU和第页<0.01（对于NS-398），对于LN229。此外，对于U87MG，正常氧的显著水平为第页BCNU和第页NS-398小于0.05。对于缺氧，显著水平为第页BCNU和第页NS-398小于0.05。

图7
(我,**ii（ii）**)实时PCR分析EMT标记物vimentin和N-cadherin的mRNA表达。与单一药物相比，BCNU和NS-398联合使用在低氧和常氧条件下对（i）LN229和（ii）U87MG细胞系上皮-间充质转化标记物（vimentin和N-cadherin）的mRNA水平的下调更大。结果表示为三个实验重复的平均值±SD。(三)LN229细胞系中N-钙粘蛋白和波形蛋白的Western blot分析。在LN229细胞系中还研究了波形蛋白和N-钙粘蛋白的蛋白质水平。再次说明，在缺氧和常氧条件下，联合用药的降幅大于单一用药。车道C表示控制，车道B表示BCNU，车道N表示NS-398，车道（B+N）表示BCNU+NS-398。

**图8。通过跨孔膜分析评估细胞迁移**
在缺氧和常氧条件下，与单一药物相比，联合药物治疗后两种细胞系的迁移减少更多。细胞的图示如所示(我)而迁移单元的百分比如所示(**ii（ii）**). 联合用药比单一用药效果更好。这对正常氧来说是真的(第页BCNU和第页与NS-398相比<0.05）以及缺氧(第页BCNU和第页<0.01（对于NS-398），对于LN229。此外，对于U87MG，正常氧的显著水平为第页BCNU和第页对于NS-398，<0.05。对于缺氧，显著水平为第页BCNU和第页NS-398小于0.01。

图9
照片(我)U87MG细胞的胶质瘤球。在缺氧和常氧条件下用单一药物治疗后，U87MG细胞的胶质瘤球大小减小。经联合治疗后，在两种情况下，胶质瘤球的形成均被消除，尽管观察到一些小于100μm的小细胞簇。(**ii（ii）**)U87MG胶质瘤球CD133表达分析。在缺氧和常压下药物治疗胶质瘤球48小时后，通过流式细胞术检测CD133的表达。与单一药物相比，联合用药（BCNU+NS-398）治疗的胶质瘤球在缺氧和常压条件下CD133的表达降低。每个图上的数字描述了CD133阳性细胞的百分比。

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