Imaging of angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells by uptake of exosomes secreted from hepatocellular carcinoma cells

doi:10.1038/s41598-018-24563-0

.2018年4月30日；8(1):6765.

doi:10.1038/s41598-018-24563-0。

肝细胞癌细胞分泌的外泌体对人脐静脉内皮细胞血管生成的影响

Yukawa广岛^1 2, 铃木高茹^三, 青木凯塔^三, 有本智子^三, 高高雅穗^三 4 5, 诺里塔达·卡吉^三 4 5, 石川哲也⁶, Ochiya高弘⁷, 吉野巴巴^{8 9 10 11 12}

附属公司

¹名古屋大学工程研究生院生物分子工程系，日本名古屋市志库区福罗町，464-8603。h.yukawa@nanobio.nagoya-u.ac.jp。
²ImPACT先进纳米生物器件研究中心，名古屋大学，Furo-cho，Chikusa-ku，Nagoya，464-8603，Japan。h.yukawa@nanobio.nagoya-u.ac.jp。
^三名古屋大学工程研究生院生物分子工程系，日本名古屋市志库区福罗町，464-8603。
⁴ImPACT先进纳米生物器件研究中心，名古屋大学，Furo-cho，Chikusa-ku，Nagoya，464-8603，Japan。
⁵日本名古屋市Chikusa-ku，Furo-cho，PRESTO，JST，464-8603。
⁶名古屋大学医学研究生院医学技术系，日本名古屋市东区Daikominami，461-8673。
⁷日本东京中央区筑地5-1-1号国立癌症中心研究所分子和细胞医学部，邮编：104-0045。
⁸名古屋大学工程研究生院生物分子工程系，日本名古屋市志库区福罗町，464-8603。babaymtt@chembio.nagoya-u.ac.jp。
⁹ImPACT先进纳米生物器件研究中心，名古屋大学，Furo-cho，Chikusa-ku，Nagoya，464-8603，Japan。babaymtt@chembio.nagoya-u.ac.jp。
¹⁰名古屋大学未来社会创新研究所，日本名古屋市志库区福罗町，464-8603。babaymtt@chembio.nagoya-u.ac.jp。
¹¹国家先进工业科学技术研究所（AIST）健康研究所，2217-14，Hayashi-cho，Takamatsu，761-0395，日本。babaymtt@chembio.nagoya-u.ac.jp。
¹²台湾省高雄市新川一路100号高雄医科大学药学院，邮编807。。babaymtt@chembio.nagoya-u.ac.jp。

PMID： 29713019
预防性维修识别码： PMC5928189
内政部： 10.1038/s41598-018-24563-0

肝细胞癌细胞分泌的外泌体对人脐静脉内皮细胞血管生成的影响

Yukawa广岛等。科学代表. 2018.

.2018年4月30日；8(1):6765.

doi:10.1038/s41598-018-24563-0。

作者

Yukawa广岛^1 2, 铃木高茹^三, 青木凯塔^三, 有本智子^三, 高高雅穗^三 4 5, 诺里塔达·卡吉^三 4 5, 石川哲也⁶, Ochiya高弘⁷, 吉野巴巴^{8 9 10 11 12}

附属公司

¹名古屋大学工程研究生院生物分子工程系，日本名古屋市志库区福罗町，464-8603。h.yukawa@nanobio.nagoya-u.ac.jp。
²ImPACT先进纳米生物器件研究中心，名古屋大学，Furo-cho，Chikusa-ku，Nagoya，464-8603，Japan。h.yukawa@nanobio.nagoya-u.ac.jp。
^三名古屋大学工程研究生院生物分子工程系，日本名古屋市志库区福罗町，464-8603。
⁴ImPACT先进纳米生物器件研究中心，名古屋大学，Furo-cho，Chikusa-ku，Nagoya，464-8603，Japan。
⁵日本名古屋市千草区富罗町PRESTO JST，邮编464-8603。
⁶名古屋大学医学研究生院医学技术系，日本名古屋市东区Daikominami，461-8673。
⁷日本东京中央区筑地5-1-1号国立癌症中心研究所分子和细胞医学部，邮编：104-0045。
⁸名古屋大学工程研究生院生物分子工程系，日本名古屋市志库区福罗町，464-8603。babaymtt@chembio.nagoya-u.ac.jp。
⁹ImPACT先进纳米生物器件研究中心，名古屋大学，Furo-cho，Chikusa-ku，Nagoya，464-8603，Japan。babaymtt@chembio.nagoya-u.ac.jp。
¹⁰名古屋大学未来社会创新研究所，日本名古屋市千草区富良町，464-8603。babaymtt@chembio.nagoya-u.ac.jp。
¹¹国家先进工业科学技术研究所（AIST）健康研究所，2217-14，Hayashi-cho，Takamatsu，761-0395，日本。babaymtt@chembio.nagoya-u.ac.jp。
¹²台湾省高雄市新川一路100号高雄医科大学药学院，邮编807。。babaymtt@chembio.nagoya-u.ac.jp。

PMID： 29713019
预防性维修识别码： PMC5928189
内政部： 10.1038/s41598-018-24563-0

摘要

肝细胞癌（HCC）是一种典型的高血管性肿瘤，了解HCC血管生成的机制对其治疗具有重要意义。然而，肝癌细胞分泌的外泌体（HCC-exosomes）对血管生成的影响尚不清楚。本文通过血管生成成像研究了HepG2细胞分泌的外泌体（HepG2-exosomes）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）管腔形成的影响。HUVEC的管腔形成程度取决于HepG2-exosomes的数量。HepG2-exosomes表达NKG2D（一种免疫细胞激活受体）和HSP70（一种通过血管内皮生长因子（VEGF）受体与血管生成相关的应激诱导热休克蛋白）。此外，HepG2-exosomes含有一些据报道存在于肝癌患者血清中的microRNAs（miRNAs）。这些结果表明，HCC-异体在血管生成中起着重要作用。进一步研究HCC-exosomes的功能可能为HCC治疗提供新的靶点。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
HepG2细胞分泌的外泌体的分离、表征和观察。(一)在试管底部通过ExoQuick TC试剂盒分离的HepG2细胞分泌的外泌体（HepG2外泌体）被发现为白色颗粒。两个白色箭头都显示了外泌体。(b条)HepG2分泌的外泌体的透射电镜图像。(**c（c）**)HepG2-exosomes在蒸馏水中的粒径分布、平均粒径和zeta电位。(**d–h日**)标记分子CD63、CD81、NKG2D和HSP70在HepG2-exosomes表面的表达。(我)用BCA法测定HepG2分泌的外泌体的蛋白质浓度。(**j–m**)用FITC-标记的抗人CD63小鼠单克隆抗体检测HepG2细胞中的外显子。细胞的形态(j个)，核标记为Hoechst33342(k个)，用FITC标记的抗人CD63小鼠单克隆抗体标记的外泌体存在于HepG2细胞中(我)核和外泌体的合并图像(米)如图所示。白色箭头表示外泌体。(**n、 o个**)Hoechst33342标记细胞核的三维图像(n个)与FITC-标记的抗人CD63小鼠单克隆抗体结合的外显子(o个)发现于HepG2细胞中。白色箭头表示外泌体。这些数字是使用超分辨率结构照明显微镜（SR-SIM，卡尔蔡司）获得的。

图2
HepG2-exosomes处理的HUVEC的管腔形成。(一)给出了实验协议的原理图。上图显示了培养基和补充剂的制备，如HepG2培养基（阴性对照）、HUVEC培养基（阳性对照）、HepG2-sup培养上清液（HepG2-sup）、纯化的HepG2-外体（HepG-exosomes）和去除外体的HepG2培养上清液（Hep G2-sup-exo）。下图显示了用于评估涂有生长因子减少基质的平板中HUVEC管腔形成的制剂。用相控显微镜观察Matrigel上HUVEC的管腔形成。(**b、 c、e、f、h**)HUVEC在各种培养条件下的内腔形成，如HepG2培养基（阴性对照）、HUVEC培养基（阳性对照）、HepG2-培养上清（HepG2-sup）、添加到Hep G2培养液中的纯化HepG2-exosomes（HepG-exosomes）以及去除外泌体的HepG2-up-exo培养上清。(d日)HepG2培养基（阴性对照）和HUVEC培养基（阳性对照）之间HUVECs形成的管腔长度的比较。(克)比较HepG2培养上清液（HepG2-sup）、纯化HepG2-外泌体（HepG2-exosomes）和去除外泌物的HepG2培养上清（HepG-sup-exo）中HUVEC形成的管腔长度。这些数据显示为三个重复值的平均值±标准偏差****P（P）* < 0.001.

图3
通过摄取HepG2细胞分泌的外泌体对HUVECs进行血管生成成像。(**a–c**)HUVEC对PKH26标记的HepG2-exosomes的摄取。这些图像通过共焦激光扫描显微镜成像。(**d–h日**)HUVEC形成的管腔中HepG2-异形体的内化。用DilC标记HUVEC的膜和细胞核₁₂（3）和Hoechst33342。HepG2-exosomes用PKH67标记。白色箭头显示形成管腔结构的HUVEC中包含的HepG2-异形体。这些图像通过共焦激光扫描显微镜成像。

图4
HepG2细胞孵育时间对HUVEC产生外泌体和腔形成的影响。(一)HepG2细胞分泌的外泌体数量（1×10⁵细胞）在37°C下培养不同时间（0、24、72、96和120小时）。(b条)HUVEC在HepG2细胞分泌的外泌体（1×10）存在下的管腔形成⁵细胞）培养不同数量的HepG2-exosomes。(**c（c）**)HepG2（1×10）分泌的外泌体存在时形成的HUVEC管腔结构的长度⁵细胞）孵育不同数量的HepG2外泌体。这些数据显示为三个重复值的平均值±标准偏差***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001.

图5
HUVEC中HepG2-exosomes和RNAs的标记。(一)PKH26标记的HepG2-exosomes并入HUVEC。(b条)HUVEC中标记有SYTO-RNASelect的RNA和miRNAs。(**c（c）**)HUVEC的核标记为Hoechst33342。(d日)HUVEC中PKH26标记的HepG2-exosomes与SYTO-RNASelect标记的RNAs和miRNAs的融合图像。

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1. Jemal A等人，《癌症统计》，2008年。CA：癌症。临床杂志。2008;58:71–96.-公共医学
1. 肖文华，等。5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肝癌外泌体免疫相关蛋白的影响。世界胃肠病学杂志。2010;16:2371–2377. doi:10.3748/wjg.v16.i19.2371。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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[3] Jemal A等人，《癌症统计》，2008年。CA：癌症。临床杂志。2008;58:71–96.-公共医学

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