Neural stem cell quiescence and stemness are molecularly distinct outputs of the Notch3 signalling cascade in the vertebrate adult brain

doi:10.1242/dev.161034

.2018年5月15日；145（10）：开发161034。

doi:10.1242/dev.161034。

神经干细胞静止和干细胞是脊椎动物成年脑中Notch3信号级联的不同分子输出

伊曼纽尔·丹荣^1 2, 萨拉·奥蒂卡·加蒂^1 2, 塞巴斯蒂安·梅拉^2 3, Chirag尼泊尔⁴, 亚历山德罗·阿卢尼^5 2, 劳雷·巴利·库夫^5 2

附属公司

¹巴斯德研究所，斑马鱼神经遗传学研究所，发育与干细胞生物学系，法国巴黎Dr Roux路25号，75015。
²CNRS，UMR3738，25 rue du Dr Roux，75015 Paris，France，法国巴黎。
³巴斯德研究所，干细胞与发育研究所，发育与干细胞生物学系，25 rue du Dr Roux，75015 Paris，France。
⁴哥本哈根大学生物技术研究与创新中心，丹麦哥本哈根2200号。
⁵巴斯德研究所，斑马鱼神经遗传学研究所，发育与干细胞生物学系，法国巴黎Dr Roux路25号，75015laure.bally-cuif@pastur.fr alessandro.alunni@pasteur.fr。

PMID： 29695612
预防性维修识别码： PMC6001379型
DOI（操作界面）： 10.1242/开发161034

神经干细胞静止和干细胞是脊椎动物成年脑中Notch3信号级联的不同分子输出

伊曼纽尔·丹荣等。开发. 2018.

.2018年5月15日；145（10）：开发161034。

doi:10.1242/dev.161034。

作者

伊曼纽尔·丹荣^1 2, 萨拉·奥蒂卡·加蒂^1 2, 塞巴斯蒂安·梅拉^2 3, Chirag尼泊尔⁴, 亚历山德罗·阿卢尼^5 2, 劳雷·巴利·库夫^5 2

附属公司

¹巴斯德研究所，发育与干细胞生物学系斑马鱼神经遗传学研究所，法国巴黎，邮编75015，鲁克斯路25号。
²CNRS，UMR3738，25 rue du Dr Roux，75015 Paris，France，法国巴黎。
³巴斯德研究所，干细胞与发育研究所，发育与干细胞生物学系，25 rue du Dr Roux，75015 Paris，France。
⁴哥本哈根大学生物技术研究与创新中心，丹麦哥本哈根2200号。
⁵巴斯德研究所，斑马鱼神经遗传学研究所，发育与干细胞生物学系，法国巴黎Dr Roux路25号，75015laure.bally-cuif@pastur.fr alessandro.alunni@pastur.fr。

PMID： 29695612
预防性维修识别码： PMC6001379型
DOI（操作界面）： 2012年10月12日/2011年11月1日

摘要

成年脊椎动物大脑中的神经干细胞（NSCs）处于静止状态，可以保持长期的祖细胞潜能（干性）。这两个属性是否以及如何关联，以及它们在多大程度上可以由NSC维护路径独立控制，尚待解决。我们之前已经确定Notch3信号通路是斑马鱼大脑皮层成体神经干细胞的主要静息传递途径。我们现在证明Notch3也控制NSC干细胞。使用平行转录组特征缺口3突变的神经干细胞和成年神经干细胞的生理状态，我们证明了一组潜在的直接Notch3靶基因可以区分静止和茎干控制。作为原理证明，我们将重点放在一个“干细胞”靶点上，编码bHLH转录因子Hey1，该靶点尚未在成人NSC中进行分析。我们发现成人大脑皮层神经干细胞Hey1功能的丧失体内包括静止的神经干细胞，在不影响其增殖状态的情况下导致分化。这些结果表明，静止和茎干是Notch3信号的不同分子输出，并确定Hey1是脊椎动物成年脑中控制NSC茎干的主要Notch3效应器。

关键词：Hey1；神经干细胞；缺口3；钯；静止；茎干。

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利益冲突声明

竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

**图1。**
**Notch3控制放射状胶质细胞的静止和干细胞。**（A-B）在野生型7 dpf幼虫中检测到苍白球VZ的三种祖细胞类型。（C） 7 dpf患者大脑皮层VZ的前体*缺口3^−/−*幼虫。（A，C）端脑横截面上RG标记物BLBP（绿色）和增殖标记物PCNA（品红色）的双重免疫细胞化学（DAPI复染）。（A′，C′）A，C.qRG，绿色箭头中方框内区域的高倍放大；aRG，白色箭头；aNP，洋红色箭头。（B）胚胎后大脑皮层主要神经原级联的示意图，带有诊断标记。至少有一些RG在qRG和aRG州之间过境（Chapouton等人，2010年）。N、神经元。（D）中等苍白球水平横截面上每100µm VZ计数的RG总数（qRGs+aRGs）。在所考虑的时期内，不同阶段和不同基因型之间没有显著差异。（E）与野生型和*缺口3^−/−*同胞幼虫**P（P）*Holm校正后<0.05，否则无显著性。（F）与野生型和野生型相比，在中等苍白球水平下，每100µm VZ横截面上计数的BrdU阳性RG总数（qRGs+aRGs）介于7 dpf（t0，无追踪）和10 dpf（追踪3天）之间*缺口3^−/−*同胞幼虫。（G，H）与野生型（G）和*缺口3^−/−*（H）同胞幼虫。黑线和星号：带有Holm多重比较修正的统计数据**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01. 红线和星号：LSD测试用于比较2天和3天的追逐。aNP的比例显著下降，神经元的比例显著增加*缺口3^−/−*仅突变体(*P（P）*=0.007和*P（P）*分别为0.002）。绿色星号：野生型和*缺口3^−/−*追捕3天。神经元的比例在*缺口3^−/−*突变体与野生型(*P（P）*=0.02). 比例尺：A、C中的10µm；A′、C′中为20µm。（D-F）n个=每种情况6-11个端脑。

**图2。**
**7 dpf放射状胶质细胞Notch3依赖基因的RNAseq鉴定。**（A，B）放射状胶质细胞（RGs）(*gfap:gfp*，绿色，箭头）在7 dpf端脑的横截面上观察到*缺口3^+/+*和*缺口3^−/−*兄弟幼虫，用于FACS分类。（C）显示门控策略的代表性FACS点图。FSC/SSC绘图和选定的细胞，然后对DAPI阴性（中面板）和GFP表达（右面板）进行选通。（D） 7 dpf RG中DEG列表中显著富集的GO术语列表（按富集分数排序）*缺口3^−/−*和野生型同胞幼虫（红色，富含突变体；蓝色，富含野生型）（另见表S4). （E）本研究中使用的RBPJ/Su（H）结合位点的位置-重量矩阵（图形表示）。（F）基因下调或上调的热图*缺口3^−/−*与…相比*缺口3^+/+*幼虫和可能的RBPJ结合位点。显示截止：log（折叠变化）>1。另请参见表S1和S2.比例尺：20µm。

**图3。**
**RG静止和茎干标记的RNAseq鉴定。**（A）大脑皮层VZ区的高分辨率视图*her4:drfp；mcm5:egfp系统*双转基因成虫，突出FACS分类的祖细胞类型。通过免疫细胞化学对RFP（洋红色）和GFP（绿色）进行交叉切片处理（左侧面板，洋红色通道；中间面板，绿色通道；右侧面板，合并）。彩色箭头表示不同的单元格类型（蓝色，qRG；红色，aRG；绿色，aNP）（如E）。比例尺：10μm。（B-D）显示选通策略的典型FACS点图。FSC/SSC绘图和选定的单元格（B，C），然后根据RFP和GFP强度（D）进行选通。（E）对500份样本的主成分分析显示，不同FACS分类的生物复制品（蓝色，qRGs；红色，aRGs；绿色，aNPs）之间的变异性最大。（F）维恩图说明了回收的二甘醇在不同细胞状态比较及其生物学解释之间的位置。

**图4。**
**潜在的直接Notch3靶点可识别与茎和静止相关的基因。**（A）说明细胞状态比较之间恢复的差异表达基因相对分布的维恩图(表S5-S7)和*缺口3^+/+*和*缺口3^−/−*RGs公司(表S1和S2). 红色，与静止/增殖和干性/承诺相关的转录物；绿色，与静止/增殖相关的转录物；紫色，与stemness/承诺相关的成绩单。（B）热图描述了A中三个相关类别中确定的基因的表达（组I-III，颜色编码如A中所示），并标记了潜在的直接Notch3靶点（左栏，红色：具有潜在的RBPJ-结合位点，图2E，F）。（C）潜在的直接Notch3靶点属于A中定义的三个相关基因类别（颜色编码如A和B，左列）。

**图5。**
**Hey1活性维持成人大脑皮层生发区的增殖祖细胞状态。**（A） A的横截面*gfap:gfp*中等前后水平的转基因大脑皮层，GFP（RGs）和Mcm5（增殖细胞）双重免疫染色。祖细胞（qRGs、aRGs和aNPs）局限于心室区（箭头，见高倍插图）。（B，C）的表达式嘿1和*缺口3*由透露就地成人大脑皮层横截面杂交（与A水平相同）。表达式仅限于VZ（箭头）。（D）评估Hey1功能的实验方案。嘿1将荧光素标记的吗啉酸（MO）注入脑室并电穿孔。电穿孔后2天评估MO-遗传细胞（荧光素阳性）的命运。（E-G）三重免疫染色的代表性示例，以揭示电穿孔苍白球横截面中的细胞状态[绿色，荧光素；灰色，谷氨酰胺合成酶（RGs）；品红，Pcna（增殖细胞）]。单元格类型示例用彩色箭头表示，如H中所定义。比例尺：A-C中为50μm；E-G.（H）Hey1阻断后细胞状态/类型变化的量化。绘制了MO遗传群体中每个细胞状态/类型的比例。Hey1阻断后，神经元的比例显著增加，而增殖细胞类型（aRG和aNP）的比例显著降低。qRG的比例不变[嘿1ATG MO相对于ATG控制MO，*P（P）*=0.59;嘿1拼接MO与ATG控制MO，*P（P）*=0.09（霍尔姆修正后）]。每个大脑计数的细胞数：对照组为196-796，对照组为137-413嘿1ATG MO和49-493her1（her1）拼接MO。n个=每种情况下3-5个大脑**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001.

**图6。**
**Hey1-depleted RG会丢失stemness字符。**（A-D）Hey1废除对成年RGs中Sox2表达的影响。（A）实验方案：荧光标记MO（控制MO或嘿1剪接MO）电穿孔至大脑皮层VZ，3天后分析Sox2的表达。（B，C）Gs（白色）和Sox2（品红色）的电穿孔VZ双重免疫染色示例，含MO的细胞呈绿色。彩色箭头表示不同的单元格类型（参见D）。（D） MO电穿孔细胞内Sox2阳性（蓝色）和阴性（绿色）RG比例的量化。（E-J）Hey1废除对RG再激活电位的影响。（E）实验方案：将荧光标记的MO电穿孔至大脑皮层VZ，并在电穿孔后2至4天将LY411575（或载体DMSO）应用于游泳水中。第4天分析RG增殖。（F-I）针对Gs（白色）和PCNA（品红）进行双重免疫处理的全山电穿孔/LY-治疗大脑的典型示例。（J）不同细胞类型比例的量化（颜色代码如E所示）。LY处理在对照MO电穿孔时诱导RG活化（qRG比例降低，aRG比例增加），但在Hey1功能被废除时无作用。每个大脑计数的细胞数：用DMSO处理的对照MO为99-293；经二甲基亚砜处理的拼接MO为153-298；用LY处理的对照MO为98-262；和151-353用于经LY处理的拼接MO。n个=每种情况下3-5个大脑**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001，所有两两比较均按照霍尔姆程序进行了多重比较调整。比例尺：B、C中为10µm；F-I中为70µm。

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