Caffeic Acid and Metformin Inhibit Invasive Phenotype Induced by TGF-β1 in C-4I and HTB-35/SiHa Human Cervical Squamous Carcinoma Cells by Acting on Different Molecular Targets

doi:10.3390/ijms19010266

.2018年1月16日；19(1):266.

doi:10.3390/ijms19010266。

咖啡因和二甲双胍通过作用不同分子靶点抑制TGF-β1诱导的C-4I和HTB-35/SiHa人宫颈鳞癌细胞侵袭性表型

Malgorzata Tyszka-Czochara公司¹, 马尔戈扎塔·拉索塔², 马金·马吉卡^三

附属公司

¹波兰克拉科夫市Medyczna 9，30-688，Jagiellonian大学医学院药学系食品化学与营养系。mtyszka@poczta.fm。
²波兰克拉科夫Kopernika 7，31-034，Jagiellonian大学医学院医学院医学生物化学系主席。malgorzata.lasota@uj.edu.pl。
^三波兰克拉科夫威利克卡258号贾吉隆大学医学院医学院移植系，邮编：30-688。mmajka@cm-uj.krakow.pl。

PMID： 29337896
预防性维修识别码：第5796212页
内政部： 10.3390/ijms19010266

咖啡酸和二甲双胍通过作用于不同分子靶点抑制TGF-β1诱导的C-4I和HTB-35/SiHa人宫颈鳞状细胞侵袭表型

Malgorzata Tyszka-Czochara公司等。国际分子科学杂志. 2018.

.2018年1月16日；19(1):266.

doi:10.3390/ijms19010266。

作者

Malgorzata Tyszka-Czochara公司¹, 马尔戈扎塔·拉索塔², 马金·马吉卡^三

附属公司

¹波兰克拉科夫Medyczna 9，30-688，Jagiellonian大学医学院药学院食品化学与营养系。mtyszka@poczta.fm。
²波兰克拉科夫Kopernika 7，31-034，Jagiellonian大学医学院医学院医学生物化学系主席。malgorzata.lasota@uj.edu.pl。
^三波兰克拉科夫威利克卡258号贾吉隆大学医学院医学院移植系，邮编：30-688。mmajka@cm-uj.krakow.pl。

PMID： 29337896
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摘要

在上皮性癌的进展过程中，细胞可能会失去上皮标记物，并通过上皮-间充质转化（EMT）获得间充质表型。上皮癌细胞向间质样特征的这种转化有利于可塑性并支持其迁移能力。本研究的目的是评估天然化合物咖啡酸（CA）单独使用以及与抗糖尿病药物二甲双胍（Metformin）联合使用对两种人类宫颈鳞癌细胞系C-4I和HTB-35/SiHa细胞转移进展的影响。EMT程序是由两种上皮细胞系暴露于TGF-β1而触发的。实时PCR分析与上皮/间充质表型相关的基因表达模式，western blot检测蛋白量。CA和Met治疗人类鳞癌细胞会抑制细胞的运动，其效果取决于特定的细胞系。这两种化合物通过干扰不同的分子靶点来调节C4-I和HTB-35细胞中的EMT过程。在TGF-β1刺激的C4-I细胞中，CA抑制间充质转录因子SNAI1的表达，从而导致上皮标记物E-cadherin、Occludin和Claudin的表达增强。此外，CA被阻止基质金属蛋白酶-9并加强监管TIMP公司-1表达，MMP-9的特异性抑制剂。在TGF-β1刺激的HTB-35细胞中，Met降低了波形蛋白的表达。通过抑制缺氧主调节器HIF-1α，Met导致CAIX公司，一种参与侵袭性恶性细胞转移的酶。在本研究中，我们发现CA和Met通过不同的机制抑制癌细胞的EMT过程。然而，当混合使用时，化合物对EMT的影响大于单独使用每种化合物。这是第一份报告显示CA单独和与Met联合治疗可以逆转TGF-β1治疗的宫颈癌细胞的间充质表型，我们认为使用这两种小分子可能被视为转移性宫颈癌的潜在治疗方法。

关键词：咖啡酸；碳酸酐酶IX；宫颈癌；上皮标记物；上皮-间充质转化；缺氧；间充质标志物；转移；二甲双胍。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
TGF-β1诱导C4-I和HTB-35细胞的上皮-间充质转化（EMT）(A类–C类). 将人宫颈鳞癌细胞系C-4I和HTB-35细胞培养48 h，并添加10 ng/mL TGF-β1。未经处理的细胞在相同条件下生长并用作对照。实时PCR分析显示，与未经处理的对照组相比，E-cadherin转录水平在第页在TGF-β1刺激的C-4I细胞中<0.01，而在HTB-35中，E-钙粘蛋白mRNA水平的下降在第页< 0.05. 请注意，如qPCR所测，TGF-β1导致两种癌细胞系中的波形蛋白表达显著增加((A类),第页与未经治疗的对照组相比，C-4I细胞和第页HTB-35细胞与未经处理的对照组相比<0.01），并通过Western blot分析证明((B类)20μg总细胞裂解物进行SDS-PAGE，然后进行免疫印迹和化学发光检测；β-actin作为负荷控制）。实验重复三次，结果相似；实时PCR数据以平均值±SD表示(A类)，显示了具有代表性的免疫印迹(B类). 细胞与TGF-β1孵育48小时后，两种细胞系都发生了形态学变化，如相差显微镜所示(C类). TGF-β1处理后C-4I和HTB-35细胞散射增强。

图2
咖啡因（CA）和二甲双胍（Met）对体外C4-I细胞迁移的影响(A类,B类). 将C4-I细胞培养至亚汇合状态，然后在细胞单层上划痕。然后，添加测试化合物（100μM的CA和/或10 mM的Met）培养细胞，并添加/不添加10 ng/mL的TGF-β1培养24小时。对于每个划痕，分别在0小时和24小时通过倒置光学显微镜（德国汉堡奥林巴斯IX-70）获得图像。使用图像J（v1.44；美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院），移民率被量化为刮痕减少的变化。注意，CA/Met在TGF-β1处理的细胞中引起最大的划痕减少((B类),第页CA/Met与对照组相比<0.01，第页CA/Met与Met相比<0.05，第页<0.05（CA/Met vs.CA）以及TGF-β1未经处理的细胞((B类),第页CA/Met与对照组相比<0.05，第页CA/Met vs.Met<0.05，第页CA/Met与CA的对比<0.05）。所有条形图显示三个实验的平均值，误差条形图表示平均值的标准误差(B类).

图3
咖啡因（CA）和二甲双胍（Met）对HTB-35细胞体外迁移的影响(A类,B类). 将HTB-35细胞培养至亚汇合状态，然后在细胞单层上制作损伤线。然后，添加受试化合物（100μM的CA和/或10 mM的Met）并添加/不添加10 ng/mL的TGF-β1培养细胞24小时。展示了在用100μM浓度的CA、10 mM Met或这两种化合物处理细胞后，在HTB-35细胞系上进行划痕试验的代表性图像。抓取后0和24小时拍摄图像(A类). 通过伤口愈合测定测定CA和/或Met对细胞运动性的影响，并以培养24小时后每次划痕的减少表示((A类)使用Image J程序分析各创面的变化；图像J v1.44；美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）。请注意，Met的影响大于CA((B类),第页<0.05（CA vs.Met）和HTB-35细胞系中的CA/Met((B类),第页<0.05（Met vs.Met/CA）。此处显示的数据来自重复三次的具有代表性的实验，结果类似(A类,B类). 划痕试验的量化表示为平均值±SD(B类).

图4
咖啡因（CA）和二甲双胍（Met）对C4-I细胞上皮标记物表达的影响。用TGF-β1（10 ng/mL）加CA（100μM）和/或Met（10 mM）处理细胞48小时。同时，用受试化合物处理培养物，但不制备TGF-β1。E-钙粘蛋白mRNA水平分析(*CDH1型*)，β-连环蛋白(*CTNNB1公司*)，阻塞(*OCLN公司*)和克劳丁(*CLDN1型*)采用实时PCR进行((A类)左侧面板(B类–D类)）。通过western blot分析E-cadherin的蛋白质水平，如图4A的右侧面板所示（对20μg总细胞裂解物进行SDS-PAGE，然后进行免疫印迹和化学发光检测，并使用β-肌动蛋白作为蛋白质负载控制，详细信息见材料和方法）。注意，当CA应用于Met时，检测到E-cadherin转录的最大上调((A类)，左侧面板）；Occludin也有同样的效果(C类)和克劳丁(D类) (*第页与E-cadherin对照组相比<0.05*第页<0.05，与对照组相比*第页<0.01（与Claudin的对照组相比）。对于qPCR，数据根据标准化*GAPDH公司*转录本作为参考基因，RNA表达水平用2^{−ΔΔC类t吨}方法(*第页<0.05和**第页与对照组相比<0.01，^# 第页与TGF-β1对照组相比<0.05）。实验重复三次，结果相似，表示为平均值±SD。

图5
咖啡酸（CA）和二甲双胍（Met）对C4-I细胞中调节EMT的转录因子表达的影响。用TGF-β1（10 ng/mL）加CA（100μM）和/或Met（10 mM）处理细胞48小时。同时，将两种细胞系的培养物与受试化合物一起培养，但不添加TGF-β1。关键EMT启动子的表达*国民账户体系*(A类),*ZEB1号机组*(B类)*; 扭曲1*(C类)和*扭转2*(D类)通过qPCR在mRNA水平上进行评估。通过western blot检测蜗牛1的蛋白质水平((A类)，右侧面板）。按照材料和方法中的描述，在对细胞裂解物进行SDS-PAGE分离后，制备免疫印迹（20μg总细胞裂解物经过SDS-PACE，然后进行免疫印迹和化学发光检测，并使用β-肌动蛋白作为蛋白载量控制）。在TGF-β1刺激的细胞中((A类)，左侧面板）和蛋白质量((A类)SNAI）被CA和CA/Met显著下调。Met下调*扭转-1*表达和CA降低mRNA扭转2。数据根据标准化*GAPDH公司*转录本作为参考基因，RNA表达水平用2^{−ΔΔC类t吨}方法(*第页<0.05和**第页与对照组相比<0.01，^# 第页<0.05和^## 第页与TGF-β1对照组相比<0.01）。条形图代表三个实验的相对平均转录物丰度±SD。结果来自三个独立的实验。

图6
咖啡酸（CA）和二甲双胍（Met）对明胶酶表达的影响*基质金属蛋白酶-*9 (A类)和*基质金属蛋白酶-*2 (C类)和组织抑制剂*TIMP-1公司*(B类)和*TIMP-2型*(D类)在C4-I细胞中。加入测试化合物（100μM的CA和/或10 mM的Met）并加入/不加入10 ng/mL的TGF-β1培养细胞48 h。然后分离和纯化mRNA以进行实时PCR检测。在TGF-β1刺激的细胞中，CA和CA/Met导致mRNA水平下降*基质金属蛋白酶-9*(第页与对照组相比<0.01），其特定组织抑制剂的mRNA随之增加*TIMP-1公司*(第页与对照组相比<0.01）。TGF-β1处理细胞与CA/Met的孵育减弱了血管生成分子的表达蔬菜(E类). 此处显示的数据重复三次，结果相似，以平均值±标准差表示(B类).

图7
Met抑制HTB-35细胞中间充质标志物波形蛋白的表达。用TGF-β1（10 ng/mL）加CA（100μM）和/或Met（10 mM）处理细胞48小时。同时，用测试化合物处理细胞培养物，但不添加TGF-。使用2^{−ΔΔC类t吨}方法(*GAPDH公司*是一个参考基因）。western blot检测波形蛋白的蛋白水平（右图）。按照材料和方法中的描述，在SDS-PAGE分离细胞裂解物后，制备免疫印迹（20μg总细胞裂解物进行电泳，β-actin用作蛋白质负载控制）。在TGF-β1刺激的细胞中，Met单独使用并与CA一起使用可显著降低波形蛋白的转录水平(*VIM1型*). 误差条表示三份结果（qPCR分析*第页<0.05和**第页与对照组相比<0.01，^# 第页<0.05和^## 第页与TGF-β1对照组相比<0.01）。

图8
Met在缺氧条件下抑制HTB-35细胞中CAIX的表达。细胞在常压（21%O）下培养₂或缺氧（5%O₂用CA、Met或这两种化合物进行24小时qPCR分析，以评估HIF-1α在常氧和缺氧条件下的表达(A类). RNA表达*HIF1A型*用2^{−ΔΔC类t吨}方法。mRNA水平*HIF1A型*缺氧后显著增加((A类),第页与对照组相比<0.01）。相反，Met单独和CA一起下调*HIF1A型*((B类),第页与Met对照组相比<0.01，第页与CA/Met对照组相比<0.01）。RT-PCR分析显示，低氧时暴露于Met和CA/Met的细胞中CAIX的表达显著降低((C类),*HPRT1型*是一个参考基因）。此处显示的数据代表了三个具有类似结果的实验(C类).

图9
CA和Met在抑制TGF-β1诱导的宫颈癌细胞EMT表型中的作用示意图。（↑-激活，Ⱶ-抑制）。

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