N6-methyladenosine RNA modification regulates embryonic neural stem cell self-renewal through histone modifications

doi:10.1038/s41593-017-0057-1

.2018年2月；21(2):195-206.

doi:10.1038/s41593-017-0057-1。 Epub 2018年1月15日。

N个⁶-甲基腺苷RNA修饰通过组蛋白修饰调节胚胎神经干细胞的自我更新

附属公司

¹美国加利福尼亚州拉霍亚市桑福德-伯纳姆-普雷比斯医学发现研究所NCI指定癌症中心肿瘤启动和维护项目。
²美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院计算机科学和人工智能实验室。
^三美国俄亥俄州辛辛那提儿童医院医疗中心围产期研究所生殖科学部、发育生物学部。
⁴美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那提大学儿科。
⁵开发、老化和再生计划，桑福德-伯纳姆-普雷比斯医学发现研究所，美国加利福尼亚州拉霍亚。
⁶加拿大安大略省多伦多市多伦多大学唐纳利中心分子遗传学系。
⁷美国加利福尼亚州拉霍亚市桑福德-伯纳姆-普雷比斯医学发现研究所NCI指定癌症中心肿瘤启动和维护项目。czhao@sbpdiscovery.org。

PMID： 29335608
预防性维修识别码： PMC6317335型
内政部： 10.1038/s41593-017-0057-1

N个⁶-甲基腺苷RNA修饰通过组蛋白修饰调节胚胎神经干细胞的自我更新

杨旺（Yang Wang）等。自然神经科学. 2018年2月.

.2018年2月；21(2):195-206.

doi:10.1038/s41593-017-0057-1。 Epub 2018年1月15日。

附属公司

¹美国加利福尼亚州拉霍亚市Sanford Burnham Prebys医学发现研究所NCI指定癌症中心肿瘤启动和维持计划。
²美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院计算机科学和人工智能实验室。
^三美国俄亥俄州辛辛那提儿童医院医疗中心围产期研究所生殖科学部、发育生物学部。
⁴美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学儿科。
⁵开发、老化和再生计划，桑福德-伯纳姆-普雷比斯医学发现研究所，美国加利福尼亚州拉霍亚。
⁶加拿大安大略省多伦多市多伦多大学唐纳利中心分子遗传学系。
⁷美国加利福尼亚州拉霍亚市桑福德-伯纳姆-普雷比斯医学发现研究所NCI指定癌症中心肿瘤启动和维护项目。czhao@sbpdiscovery.org。

PMID： 29335608
预防性维修识别码：第631735页
内政部： 10.1038/s41593-017-0057-1

勘误表in

出版商更正：N⁶-甲基腺苷RNA修饰通过组蛋白修饰调节胚胎神经干细胞的自我更新。
王毅、李毅、岳M、王杰、库马尔S、韦克斯勒-雷亚RJ、张Z、小川Y、凯利斯M、杜斯特G、赵JC。王毅等。自然神经科学。2018年8月；21(8):1139. doi:10.1038/s41593-018-0169-2。自然神经科学。2018 PMID：29880878

摘要

内部N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰广泛存在于信使RNA（mRNAs）中，并由甲基转移酶样蛋白3（Mettl3）和Mettl14的异二聚体催化。了解m的作用⁶在开发过程中，我们在小鼠模型中删除了胚胎神经干细胞（NSC）中的Mettl14。典型的表现是，缺乏Mettl14的神经干细胞的增殖和早期分化明显减少，这表明⁶修改增强了NSC的自我更新能力。在皮层神经发生过程中，NSC池的减少导致晚出生神经元的数量减少。从机制上讲，我们发现Mettl14基因敲除与对照组相比，特定组蛋白修饰在全基因组范围内增加。这些变化与改变的基因表达和观察到的细胞表型相关，表明敲除细胞组蛋白修饰改变的功能意义。最后，我们发现⁶A通过破坏编码组蛋白修饰酶的转录物的稳定性来调节组蛋白修饰。我们的结果表明，m的重要作用⁶A在开发中，显示m⁶A调节组蛋白修饰是哺乳动物细胞中一种未知的基因调节机制。

PubMed免责声明

数字

图1： — **图1:。*大都会14*调节小鼠大脑皮层的大小。**
（a）来自*Mettl14英尺/英尺*（WT，左侧），*梅特尔14f/f；nes-核心*（KO，中间）或*Mettl14 f/+；nes-核心*（Het，右）老鼠幼崽出生后第0天（P0）；黑色箭头表示皮层的长度和宽度。比例尺：2 mm.（b）量化P0时的皮质长度和宽度，单因素方差分析（WT:n个=16，KO:n个=7，Het:n个=8 P0脑；长度，P=2.559E-05，F（2,28）=15.79；宽度，*P（P）*= 0.0869,F类（2，28）=2.669）由Bonferroni's提供*事后（post-hoc）*测试（长度，WT vs.KO，*P（P）*=4.358E-05，95%置信区间（C.I.）=0.02383至0.06534，WT与Het，*P（P）*=0.9999，95%C.I.=−0.02521至0.01446; 宽度，WT vs.KO，*P（P）*=0.2141，95%置信区间=−0.008986至0.05154，WT与Het，*P（P）*=0.6633，95%置信区间=−0.04098至0.01686）。（c） P0冠状断面的代表性图像大脑苏木精/伊红染色（H&E）；黑色箭头表示皮质厚度。上面板中显示的部分与下面的部分来自同一个大脑但在其前面约1800。比例尺：1 mm。（d）H&E量化染色，单向方差分析(n个=26个大脑切片实验组；*P（P）*=2.9E-14，F类(2, 75) =48.61），其次是Bonferroni事后（post-hoc）测试（WT vs。让开，*P（P）*=4.9E-14，95%置信区间=170.1至279.4，重量vs.Het，*P（P）*=0.0678，95%置信区间=−3.027至106.2）。（e）冠状E17.5脑切片用Mettl14和Pax6抗体染色。从三个独立的实验中获得了类似的结果。（f）加冕E13.5、E15.5、E17.5和P0脑切片用抗Mettl14染色抗体。从三个独立的实验中获得了类似的结果。比例尺：100μM。图表示平均值±SD。点表示来自各个数据点的数据。箱线图中的水平线表示中位数；框限表示第一分位数和第三分位数；和垂直方向晶须线表示最小值和最大值。ns=无显著性*****P（P）*< 0.0001.

图2： — **图2:。*大都会14*调节神经圈培养中E14.5大脑皮层神经干细胞的自我更新。**
（a）二维薄层色谱（2D-TLC）分析米⁶核糖体缺失（Ribo-）PolyA RNA中的A水平在E14.5神经干细胞中培养7天后。蓝色虚线圆圈表示米⁶一个斑点。从三个独立的实验。（b）孤立神经球的代表性图像E14.5国家统计委员会。（c）神经球数量和面积的量化，单向方差分析(n个=所有实验组的12种细胞培养物；面积，*P（P）*=9.15E-13，F类(2, 33) = 80.21; 数字，*P（P）*= 0.0313,F类（2，33）=3.853），然后是邦费罗尼的*事后（post-hoc）*测试（面积，WT vs.KO，*P（P）*=3.2475E-11，95%置信区间=6781至10737，重量vs.Het，*P（P）*=0.2855，95%置信区间=−2999至663.1；数量，WT与KO相比，*P（P）*=0.0724，95%C.I.=−0.5596至15.39，重量vs。赫特，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=−9.31至6.643）。（d）国家安全委员会增长曲线。在6孔板中以200000/孔的速度电镀NSC，计数为24天后，双向方差分析(n个=所有人的3种细胞培养实验组；*P（P）*=8.644E-12，F类(2, 18)=143.6），然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试（WT vs。让开，*P（P）*=1.2905E-11，95%C.I.=4.133至5.666，WT vs.Het，*P（P）*=0.091，95%C.I.=−0.09277至1.44）。（e）增长曲线*大都会14*KO和未删除的对照NSC指示矢量。NSC被镀在96个钢板中，数量由MTT分析，双向方差分析(n个=3种细胞培养物实验组；*P（P）*=1.413E-20，F类(3, 24)=396.9），然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试（WT-vector与WT-FlagMettl14，*P（P）*=1.162E-08，95%置信区间=0.02849至0.0514、WT载体对KO载体，*P（P）*=1.77094E-20，95%C.I.=0.1213至0.1442，WT-vector vs.KO-FlagMettl14，*P（P）*=0.9999，95%C.I.=−0.01183至0.01107）。（f）抗Tuj1的免疫染色培养7天的神经干细胞*体外试验。*比例尺：100μM。（g）免疫染色定量，单向方差分析(n个=3个字段对于所有实验组；*P（P）*= 0.0004,F类(2,6） =38.49），其次是Bonferroni事后（post-hoc）测试（WT与KO相比，*P（P）*=0.0004，95%置信区间=−85.13至−38.65，WT与Het，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=−28.37至18.11）。图表示平均值±SD。点表示单个数据的数据点。箱线图中的水平线表示中位数；盒子的极限指示第一分位数和第三分位数；垂直晶须线表明最小值和最大值。ns=无显著性****P（P）*< 0.001, *****P（P）*< 0.0001.

图3： — 图3:。*大都会14*缺乏降低RGC增殖*体内试验。*
（a-c）用抗体染色的E17.5脑冠状切片识别BrdU、PH3和PAX6。孕妇接受BrdU脉冲30分钟在胚胎采集之前。（d） E17.5免疫染色定量部分。测定并归一化Pax6+、BrdU+和PH3+细胞的数量对未删除小鼠的可比切片进行单因素方差分析(n个=所有实验组3个脑切片；Pax6+，*P（P）*=0.0005,F类(2, 6) = 34.41; 溴化铀+，*P（P）*= 0.0231,F类(2, 6) = 7.531; PH3+，*P（P）*= 0.0002,F类（2，6）=47.73），然后是邦费罗尼的*事后（post-hoc）*测试（Pax6+，WT vs.KO，*P（P）*=0.0004，95%C.I.=0.2814至0.6025，WT与Het，*P（P）*=0.0584，95%C.I.=−0.006443至0.3146；溴化铀+，WT与KO，*P（P）*=0.0194，95%置信区间=0.08378至0.7348，重量vs。赫特，*P（P）*=0.7612，95%置信区间=−0.2218至0.4292；PH3+，重量与KO相比，*P（P）*=0.0002，95%置信区间=0.2976至0.5796，重量vs.Het，*P（P）*=0.2287，95%置信区间=−0.05332至0.2288）。（e、f）E15.5（E）和E17.5（F）脑冠状切片均经抗BrdU染色只识别BrdU的抗体和也识别BrdU公司。孕妇接受了一次碘缺乏症注射，然后是一次BrdU注射1.5小时后注射。再过0.5小时，胚胎大脑收集用于分析。（g） IdU+BrdU-细胞百分比的量化，代表在1.5小时追踪期间离开S期的细胞，在所有IdU+细胞中。单向方差分析(n个=所有实验的3个脑切片组；E15.5中，*P（P）*= 0.0025,F类(2, 6) = 19.21;E17.5，*P（P）*= 0.0075,F类（2，6）=12.35）由Bonferroni's提供*事后（post-hoc）*测试（E15.5，WT vs.KO，*P（P）*=0.0067，95%C.I.=2.835至12.6，WT与Het，*P（P）*=0.5802，95%置信区间=−6.787至2.973；E17.5，重量与KO相比，*P（P）*=0.0107，95%C.I.=2.347至13.19，WT与Het，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=−5.598至5.244）。（h，i）用抗体染色的E15.5（H）和E17.5（I）大脑冠状切片识别Ki67和BrdU。孕妇24小时注射一次BrdU在胚胎采集之前。（j） BrdU+Ki67百分比的量化-细胞，代表24小时内脱离细胞周期的细胞，在总BrdU中+细胞。单向方差分析(n个=所有实验的3个脑切片组；E15.5，*P（P）*= 0.0173,F类(2, 6) = 8.589;E17.5，*P（P）*= 0.0016,F类（2，6）=22.51）由Bonferroni's提供*事后（post-hoc）*测试（E15.5，WT vs.KO，*P（P）*=0.014，95%C.I.=4.493至29.92，WT与Het，*P（P）*=0.6051，95%置信区间=−7.885至17.54；E17.5，重量与KO相比，*P（P）*=0.01，95%置信区间=3.932至21.2，重量vs.Het，*P（P）*=0.1249，95%C.I.=−15.28至1.99）。（k，l）E17.5脑冠状切片的免疫染色中间祖细胞标记物抗Tbr2和神经前体标记物抗Neurod2。白色虚线表示VZ/SVZ区域的边界。获得了类似的结果来自三个独立的实验。比例尺：100μM。图形表示平均值±标准偏差。点表示来自各个数据点的数据。纳秒=不显著**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001.

图4： — **图4:。*大都会14*缺乏会减少晚出生神经元的数量。**
（a） P0脑冠状切片II-IV层标记染色Cux1、V层标记Sox5和VI层/基板（SP）标记Tbr1。虚线表示Cux1+和Sox5+神经元层的边界。（b）定量Cux1+、Sox5+或Tbr1+神经元层的厚度，单向方差分析(n个=所有实验组的3个脑切片；Cux1+，*P（P）*=2.689E-07，F类(2, 6) = 461.8; Sox5+，*P（P）*= 0.115,F类(2, 6) = 3.169; Tbr1+，*P（P）*= 0.8865,F类（2，6）=0.1229），然后是Bonferroni氏*事后（post-hoc）*测试（Cux1+，WT vs.KO，*P（P）*=4E-07，95%置信区间=84.39至105.9，重量vs.Het，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=−10.97至10.52；Sox5+，重量与KO相比，*P（P）*=0.1329，95%C.I.=−14.18至101.2，WT与。赫特，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=-55.32至60.06；Tbr1+，重量与KO相比，*P（P）*=0.9999，95%C.I.=−43.31至46.59，重量vs。赫特，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=−50.47至39.42）。（c）P0脑冠状切片用Ⅱ-Ⅳ层标记Satb2染色。（d）Satb2+细胞数量的量化，单因素方差分析(n个= 3所有实验组的脑切片；*P（P）*= 0.00015,F类（2，6）=53.83），然后是Bonferroni的*事后（post-hoc）*测试（WT vs.KO，*P（P）*= 0.0003, 95%C.I.=198.2至408.5，WT vs.Het，*P（P）*=0.9186，95%置信区间=−133.1至77.14）。（e） E17.5脑冠状面Cux1染色；白色虚线标记Cux1+神经元层的边界。（f）量化白线虚线内Cux1+层厚度和平均数1 mm内新生成的Cux1+细胞²，从VZ到E17.5下方的白色虚线。单向方差分析(n个= 3所有实验组的脑切片；厚度，*P（P）*=0.0019,F类(2, 6) = 21.36; 数字，*P（P）*= 0.0004,F类（2，6）=36.75），然后是Bonferroni的*事后（post-hoc）*测试（厚度，WT vs.KO，*P（P）*=0.0025，95%C.I.=9.765至30.85，WT与Het，*P（P）*= 0.9999, 95%C.I.=−10.13至10.96；数量，WT vs.KO，*P（P）*= 0.0004,95%置信区间=181.5至401.9，重量vs.Het，*P（P）*=0.7499，95%置信区间=−74.64至145.8）。比例尺：200μM。图表示平均值±SD。点表示来自各个数据点的数据。纳秒=不重要***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001, *****P（P）*< 0.0001.

图5： — **图5:。米⁶A通过组蛋白修饰调节NSC基因表达。**
（a）基于RNA-seq分析的热图分析*大都会14*KO与未删除的对照NSC。（b，c）基因本体基因下调和上调的（GO）分析*大都会14*KO与。未删除的对照E14.5 NSC。GO分析由DAVID进行。不同表达的基因有一个调整*P（P）*< 0.01以及2倍或更大的表达差异。在差异表达中1099个基因上调，1487个基因下调。基因数量计数和精确*P（P）*补充图4a中列出了每个GO项的值。（e）酸提取组蛋白的典型蛋白质印迹E14.5使用识别H3K4-1me、H3K4-3me、，H3K27–3me、H3K9–3me，H3K27-ac、H3K9-ac、泛乙酰基-H3、uH2AK119、，uH2BK120和H3S28磷酸化。乐队尺寸从17至23 KD不等预期用于修饰组蛋白。对于未裁剪的图像，请参见补充图6a。（f）E14.5和E17.5 NSC的western blot定量，单向方差分析（WT:n个=8，KO：n个=12，和Het:n个=8种独立的NSC培养；H3K4me1，*P（P）*= 0.1123,F类(2, 25) = 2.39; H3K4me3，*P（P）*=1.06442E-09，F类(2, 25) = 52.77;H3K9me3，*P（P）*= 0.2096,F类(2, 25) = 1.664;H3K27me3，*P（P）*= 0.00013,F类(2, 25) = 13.07;H3K9ac，*P（P）*= 0.1461,F类(2, 25) = 2.08; H3K27ac，*P（P）*=4.796E-06，F类(2, 25) = 20.8; H3ac，*P（P）*= 0.3676,F类(2, 25) = 1.042; H2AK119Ubi，*P（P）*= 0.3592,F类(2, 25) = 1.067; H2BK120Ubi，*P（P）*= 0.1192,F类(2, 25) = 2.319; H3S28pho，*P（P）*= 0.5347,F类（2，25）=0.642），然后是Bonferroni公司*spost hoc公司*测试（H3K4me1，WT vs.KO，*P（P）*=0.2376，95%C.I.=-0.4713至0.09065，重量vs.Het，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=-0.2629至0.3527；H3K4me3，WT相对于KO，*P（P）*=1.157E-08，95%C.I.=−0.5518至−0.3128，WT vs.Het，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=-0.134至0.1278；H3K9me3，重量vs.KO，*P（P）*= 0.4574, 95%C.I.=−0.3314至0.1054，WT vs.Het，*P（P）*= 0.9999, 95%C.I.=−0.1942至0.2842；H3K27me3，重量vs.KO，*P（P）*=0.0008，95%C.I.=−1.131至−0.2956，WT与Het，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=-0.3891至0.5256；H3K9ac，重量与KO相比，*P（P）*=0.321，95%C.I.=−0.4577至0.1121，重量vs。赫特，*P（P）*=0.1141，95%置信区间=−0.5732至0.05098；H3K27ac，WT与KO，*P（P）*=1.769E-05，95%C.I.=−1.591至−0.6358，WT vs.Het，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=-0.5908至0.4556；H3ac、WT与KO，*P（P）*=0.6463，95%置信区间。=−0.4945至0.2007，WT vs.Het，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=-0.3309至0.4307；H2AK119Ubi，WT vs.KO，*P（P）*= 0. 5288,95%C.I.=−0.1242至0.3523，WT vs.Het，*P（P）*= 0.9999,95%置信区间=−0.2759至0.2459；H2BK120Ubi，WT vs.KO，*P（P）*=0.6171，95%C.I.=−0.2165至0.5511，WT与Het，*P（P）*=0.6457，95%置信区间=-0.5982至0.2426；H3S28pho，重量vs.KO，*P（P）*=0.9999，95%C.I.=−0.2407至0.2961，WT与Het之比，*P（P）*=0.8731，95%C.I.=−0.3915至0.1965）。（f）细胞生长分析基于MTT法检测用载体/DMSO或MLL1抑制剂MM-102处理的神经干细胞CBP/P300抑制剂C646或Ezh2抑制剂GSK343。所示为吸光度每个药物剂量下KO与未删除对照的比率。单因素方差分析(n个=所有实验组的3个独立实验；GSK343，*P（P）*=4.232E-05，F类(3, 8) = 38.47; C646，*P（P）*= 0.0003,F类(3, 8) = 23.43; MM-102，*P（P）*= 0.0025,F类（3，8）=11.91），然后是邦费罗尼的*事后（post-hoc）*测试（GSK343，c vs.1.25，*P（P）*=0.0035，95%C.I.=−0.2477至−0.05943，C与2.5相比，*P（P）*=0.0002，95%C.I.=−0.3265至−0.1383，c对5，*P（P）*=1.979E-05，95%置信区间=-0.4169至-0.2287；C646，c对1.25，*P（P）*= 0.0036, 95%C.I.=−0.1158至−0.02744，C与2.5，*P（P）*=0.0236，95%C.I.=−0.09574至−0.007344，C与5，*P（P）*=0.000103，95%C.I.=−0.1654至−0.07702；MM-102，c与0.0625，*P（P）*=0.0507，95%C.I.=−8.591E-05至0.06086，c对1.25，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=-0.03858至0.02237，c与2.5，*P（P）*=0.0615，95%C.I.=−0.05958至0.001368). 图表表示平均值±SD。点表示来自单个数据点。ns=无显著性**P（P）*< 0.05,***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001, *****P（P）*< 0.0001.

图6： — **图6:。H3K27-ac抑制剂C646和H3K17-me3抑制剂GSK343拯救KO与未缺失NSC中的异常基因表达。**
（a） H3K27ac ChIP-qPCR显示*Kif26a、Gas7、，*和*Pdgfrb公司*E14.5中的基因*大都会14*KO与未删除的NSC。n=4独立所有实验组的实验，双尾非配对t检验（Kif26a，*P（P）*=0.0006，t=6.568，df=6，95%置信区间=9.594至20.99；气体7，*P（P）*=0.00013，t=8.638，df=6，95%C.I.=17.41至31.16; Pdgfrb公司，*P（P）*=0.0002，t=8.395，df=6，95%置信区间=9.27至16.9）。（b） RT-qPCR显示*Kif26a，气体7，*和*Pdgfrb公司*E14.5中的基因*大都会14*KO与未删除的NSC。n=3独立所有实验组的实验，双尾非配对t检验（Kif26a，*P（P）*=0.0002，t=12.71，df=4，95%置信区间=25.01至38.99；气体7，*P（P）*=0.0002，t=12.46，df=4，95%置信区间=11.41至17.95；Pdgfrb公司，*P（P）*=0.0008，t=9.08，df=4，95%置信区间=2.957至5.563). （c） RT-qPCR显示*Kif26a，气体7，*和*Pdgfrb公司*E14.5中的基因*大都会14*KO与使用H3K27ac治疗的未删除NSC的比较抑制剂C646。单向方差分析（n=3个独立实验实验组；Kif26a，*P（P）*= 0.0015,F类(2,6) = 23.04; 气体7，*P（P）*= 0.0027,F类(2, 6) =18.67; Pdgfrb公司，*P（P）*=8.449E-07，F类(2, 6) =314.3）之后是Bonferroni’*spost hoc公司*测试（Kif26a，c与0.625相比，*P（P）*=0.0041，95%置信区间=6.126至22.47，C与1.25，*P（P）*=0.0014，95%置信区间=9.393至25.73；气体7，c与0.625，*P（P）*=0.045，95%置信区间=0.05735至4.229，C与1.25，*P（P）*=0.0018，95%置信区间=2.207至6.379；Pdgfrb，c与0.625，*P（P）*=1.431E-05，95%置信区间=1.75至2.663，C与1.25，*P（P）*=5.418E-07，95%置信区间=3.384至4.296）。（d）H3K27–3me ChIP-qPCR显示在*第二阶段*和*出口风险3*E14.5中的基因*大都会14*KO与未删除的NSC。n=4独立所有实验组的实验，双尾非配对t检验（Egr2，*P（P）*=0.0016，t=5.463，df=6，95%置信区间=5.412至14.19；例3，*P（P）*=0.0010，t=5.928，df=6，95%C.I.=5.007至12.05). （e） RT-qPCR显示*第二阶段*和*出口风险3*E14.5中的基因*大都会14*KO与。未删除的NSC。n=所有实验组的3个独立实验，双尾非配对t检验（Egr2，*P（P）*=0.0052，t=5.603，df=4，95%C.I.=−0.3789至−0.1278；例3，*P（P）*=0.0009，t=10.67，df=4，95%C.I.=-0.7855至-0.4612）。（f）RT-qPCR显示*第二阶段*和*出口风险3*E14.5中的基因*大都会14*KO与。用H3K27–3me抑制剂GSK343处理的未删除NSC。单因素方差分析(n个=所有实验组的3个独立实验；第二阶段，*P（P）*= 0.0003,F类(2, 6) = 44.49; 例3，*P（P）*= 0.01,F类（2，6）=10.94），然后是邦费罗尼*spost hoc公司*测试（Egr2，c vs.0.625，*P（P）*=0.0007，95%C.I.=−0.4826至−0.2041，C与1.25相比，*P（P）*=0.0002，95%C.I.=−0.5526至−0.2741; Egr3，c vs.0.625，*P（P）*=0.0519，95%置信区间=-0.5627至0.002676，c与1.25，*P（P）*=0.0072，95%置信区间=−0.7227至−0.1573）。图表示平均值±标准偏差点表示来自各个数据点的数据。ns=无显著性**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001, *****P（P）*<0.0001.

图7： — **图7:。米⁶A调节CBP和p300的mRNA稳定性。**
（a）米⁶CBP和p300的A-meRIP-qPCR大都会14KO与对照E14.5 NSC。单因素方差分析(n个=所有实验组的3个独立实验；美国海关与边境保护局，*P（P）*=1.08E-06，F类(2, 6) = 289.4; 第300页，*P（P）*=3.961E-07，F类（2，6）=405.5）作者：Bonferroni'*spost hoc公司*测试（CBP，WT vs.KO，*P（P）*=1.697E-06，95%C.I.=16.18至21.63，WT vs.Het，*P（P）*=0.9999，95%置信区间=-3.13至2.316；p300，WT与KO，*P（P）*=1.113E-06，95%C.I.=21.47至28.12，WT vs.Het，*P（P）*=0.0086，95%C.I.=−8.32至−1.667）。（b）RT-qPCRCBP公司和*300页*E14.5中的转录本神经干细胞培养7天*在体外，*单向方差分析（WT:n个=21，KO:n个=33，Het:n个=所有实验组的21个独立实验；美国海关与边境保护局，*P（P）*=2.380E-21，F类(2, 72) = 98.64; 第300页，*P（P）*=2.751E-09，F类（2，72）=26.24）作者：Bonferroni'*spost hoc公司*测试（CBP，WT vs.KO，*P（P）*=1.306E-19，95%C.I.=-1.252至−0.8628，重量vs。赫特，*P（P）*=0.3029，95%置信区间=-0.3512至0.07886；第300页，WT与KO相比，*P（P）*=5.254E-09，95%C.I.=−0.6356至−0.3153，WT vs.Het，*P（P）*=0.2011，95%置信区间=-0.3058至0.04839）。（c） RT-qPCRCBP公司和*300页*放线菌素D处理的E14.5神经干细胞中的转录物。*P（P）*值由双向方差分析生成(n个=所有实验组的3个独立实验；美国海关与边境保护局，*P（P）*=1.262E-11，F类(1, 12) = 602.5; 第300页，*P（P）*=8.738E-10，F类（1，12）=291.7）后接Bonferroni'*spost hoc公司*试验（CBP，0 h，*P（P）*= 0.9999, 95%C.I.=−0.05658至0.05658，3小时，*P（P）*=1.714E-08，95%置信区间。=−0.3518至−0.2386，6小时，*P（P）*=7.954E-12，95%C.I.=−0.6268至−0.5136；第300页，0小时，*P（P）*= 0.9999,95%置信区间=−0.06777至0.06777，3小时，*P（P）*=1.988E-07，95%C.I.=−0.3522至−0.2167，6小时，*P（P）*=1.50564E-09，95%C.I.=−0.5046至−0.3691）。（d）一个模型，其中m⁶A类丢失部分通过调节mRNA稳定性改变组蛋白修饰组蛋白修饰物和改变的组蛋白修饰异常抑制增殖相关基因与激活分化相关基因导致失去NSC基态。图表表示平均值±SD。点表示来自各个数据点的数据。中的水平线箱线图表示中位数；框限表示第一分位数和第三分位数；垂直晶须线表示最小值和最大值*****P（P）*< 0.0001.

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