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。2018年2月；29(2):405-412.
doi:10.1007/s13361-017-1837-2。 Epub 2017年12月18日。

无标记定量交联/质谱的重现性研究

梅勒神父 1 2, 卢兹·菲舍尔 2, 卓安琪·陈 1 2, 塔妮娅·奥琴尼卡娃 2, 尤里·拉普西尔伯 三 4
附属公司

无标记定量交联/质谱的重现性研究

梅勒神父等。 J Am-Soc质谱。 2018年2月。

摘要

定量交联/质谱（QCLMS）是一种新兴的研究蛋白质和多亚基复合物构象变化的方法。区分蛋白质构象需要可重复地识别和量化交联肽。在这里，我们分析了使用双[磺基琥珀酰亚胺]二酸盐（BS）的多重交联反应之间的变化三)-交联人血清白蛋白（HSA），并评估如何通过LC-MS分析鉴定和量化可重复的交联肽。为了让更广泛的研究团体能够访问QCLMS，我们开发了一个工作流，该工作流集成了用于光谱预处理的既定软件工具MaxQuant、用于交联肽识别的Xi以及用于量化的Skyline（MS1过滤）。在我们的样品中鉴定出的221对独特的残基对中，124对随后在10次分析中进行了量化，变异系数（CV）值为14%（注射复制品）和32%（反应复制品）。因此，我们的结果表明，QCLMS的再现性与一般定量蛋白质组学的再现性一致，并且我们建立了基于MS1的交联肽定量的稳健工作流程。图形摘要。

关键词：交叉链接；人血清白蛋白；无标签；质谱；定量；再现性。

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图形摘要
图形摘要
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图1
图1
无标签交联量化工作流程。(一)样品制备工作流程：橙色代表反应副本，蓝色代表注射副本。(b条)使用MaxQuant进行峰值拾取、Xi进行交联识别和量化以及使用Skyline进行量化的交联识别和定量工作流程
图2
图2
天际线上的交联肽。(一)线性化交联肽的色谱图视图，显示前体同位素离子M（蓝色）、M+1（紫色）、M+2（红色）的MS1提取离子色谱图。(b条)整合和归一化后，每个复制品（1–10）的峰面积以及总同位素峰。(c（c）)呈现肽的所有10个复制品与峰尖（黑色中线）之间的保留时间[分钟]比较。(d日)显示转换BS序列方案的示例三以Skyline输入格式将交联肽转换成线性形式。(e（电子）)交联肽序列线性化的质量计算方案
图3
图3
使用Xi中的自动验证确定的唯一残基对的数据质量（n=242，包括五个诱饵，即<2%FDR）。(一)HSA（PDB:1AO6，链A）的晶体结构包含已识别的交联（黄色：BS交联极限内的交联三n=221，绿色：长距离交联（≥30°）n=21，包括五个诱饵）。(b条)观测链路的Cα距离分布（黄色、绿色）和随机距离分布（灰色）
图4
图4
反应和注射复制品中交联鉴定的再现性。(一)维恩图显示了反应（橙色）和注射复制品（蓝色）中确定的残基对的重叠。(b条)根据LC-MS运行次数绘制已识别唯一残基对的数量，显示已识别残基对数量随运行次数增加而饱和（橙色：反应副本，蓝色：注射副本，灰色：标准偏差）。(c（c）)唯一残基对的数量与副本的数量对比，显示在多少副本中观察到给定的唯一残基配对（橙色：反应副本，蓝色：注射副本）
图5
图5
残基对定量的再现性。(一)维恩图显示了反应复制品（橙色）和注射复制品（蓝色）中定量残基对的数量。(b条)鉴定的（浅色）和定量的（深色）残基对的数量（橙色：反应复制品，蓝色：注射复制品）。(c（c）)量化后每个实验的中位峰面积的变异系数（CV）（%），显示了使用交联肽进行无标签量化的再现性。(d日)装箱日志的CV2峰面积以%表示，显示残基对峰面积和CV值之间的反相关。橙色反应复制品和蓝色注射复制品
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参考文献

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