SR-BI Mediated Transcytosis of HDL in Brain Microvascular Endothelial Cells Is Independent of Caveolin, Clathrin, and PDZK1

doi:10.3389/fphys.2017.00841

.2017年10月30日：8:841。

doi:10.3389/fphys.2017.00841。 2017年电子收集。

SR-BI介导的脑微血管内皮细胞中高密度脂蛋白的转录作用与Caveolin、氯氰菊酯和PDZK1无关

Karen Y Fung（凯伦·冯）^1 2, 王长森², 斯特芬·尼亚加（Steffen Nyegaard）^三, 布莱恩·海特⁴, 格雷戈里·德·费尔恩^1 2 5, 沃伦·L·李^1 2 6

附属公司

¹加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物化学系。
²加拿大安大略省多伦多市圣米歇尔医院基南生物医学研究中心。
^三加拿大安大略省多伦多市儿童医院细胞生物学项目。
⁴加拿大安大略省伦敦市西安大略大学人类免疫学中心微生物与免疫学系。
⁵加拿大安大略省多伦多大学外科。
⁶加拿大安大略省多伦多大学医学系、实验医学系和病理生物学系。

PMID： 29163190
预防性维修识别码： PMC5670330型
内政部： 10.3389/fphys.2017.00841

SR-BI介导的脑微血管内皮细胞中HDL的细胞吞噬与Caveolin、Clathrin和PDZK1无关

冯凯伦等人。前生理学. 2017.

.2017年10月30日：8:841。

doi:10.3389/fphys.2017.00841。 2017年电子收集。

作者

Karen Y Fung（凯伦·冯）^1 2, 王长森², 斯特芬·尼亚加（Steffen Nyegaard）^三, 布莱恩·海特⁴, 格雷戈里·德·费尔恩^1 2 5, 沃伦·L·李^1 2 6

附属公司

¹加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物化学系。
²加拿大安大略省多伦多市圣米歇尔医院基南生物医学研究中心。
^三加拿大安大略省多伦多病童医院细胞生物学项目。
⁴加拿大安大略省伦敦市西安大略大学人类免疫学中心微生物与免疫学系。
⁵加拿大安大略省多伦多大学外科。
⁶加拿大安大略省多伦多大学医学系、实验医学系和病理生物学系。

PMID： 29163190
预防性维修识别码： PMC5670330型
内政部： 10.3389/fphys.2017.00841

摘要

供应大脑的血管内皮表现出极低的细胞旁和跨细胞通透性，是血脑屏障的主要组成部分。高密度脂蛋白（HDL）通过细胞转染跨越血脑屏障，但技术限制使其难以阐明其调控。采用旋转圆盘共焦和全内反射荧光显微镜相结合的方法，我们检测了人类原代脑微血管内皮细胞单层对HDL的摄取和跨细胞作用。使用这些方法，我们报告HDL内化需要动力蛋白而不是氯氰菊酯重链，并且其内化和转染是饱和的。内源性高密度脂蛋白部分与清道夫受体BI（SR-BI）共定位，SR-BI的敲除显著减弱了高密度脂素的内源性。然而，我们观察到，在其他组织中对HDL-SR-BI信号传导至关重要的衔接蛋白PDZK1并不需要在这些细胞中摄取HDL。此外，虽然这些细胞表达小窝蛋白，但该组织中小窝蛋白的丰度可以忽略不计，我们发现SR-BI和小窝蛋白不会共分。此外，小窝蛋白-1的直接沉默对HDL的摄取没有影响。最后，抑制内皮型一氧化氮合酶增加HDL内化，而增加一氧化氮水平没有影响。总之，这些数据表明，脑微血管内皮细胞中SR BI介导的转运与其他细胞类型中该受体的摄取和信号通路不同。

关键词：血脑屏障；细胞内吞；内皮细胞；内皮型一氧化氮合酶；高密度脂蛋白转染；SR-BI；小窝蛋白；氯菊酯。

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数字

图1
建立*在体外*原代人脑微血管内皮模型。**（A）**HCCMEC紧密连接蛋白ZO-1（左）和粘附连接蛋白VE-cadherin（右）染色。比例尺=45μm。**（B）**荧光-HDL脉冲相的定量。n个= 3; 每个n的每个时间点大约观察到15个细胞。^***第页<0.0001（学生）吨-测试0与30分钟。**（C）**允许HDL在4°C下结合HCCMCs 10分钟，然后冲洗以去除未结合的HDL。细胞中心附近的代表性yz轴图像（比例尺=4μm）。顶端膜用凝集素（绿色）标记，细胞核用DAPI（蓝色）染色。在时间零点，在顶端细胞表面可以看到含有HDL的小泡（白色箭头）；37°C下5分钟后，内化明显。30分钟后，大部分HDL内化并出现在基底膜附近（虚线）。**（D）**显示了HCCMEC根尖膜的典型xy图像（比例尺=6μm）。

图2
HDL内化需要动态蛋白，但不需要网格蛋白或小窝蛋白-1。**（A）**Alexa 568标记HDL的内化被40倍的未标记HDL和400 ug重组ApoA1蛋白显著抑制。量化可以在中找到**（B）**;n个=6，对于未标记的HDL和n个=3对于未标记的重组ApoA1，每个复制条件下观察到约40个细胞。**（C）**用动力学抑制剂（Dyngo4a）和胆固醇抑制剂（制霉菌素）预处理30分钟后，HDL内化显著降低。量化可以在中找到**（D）**;n个= 6; 每个n处理中观察到大约32个细胞。**（E）**siRNA对高密度脂蛋白内化无影响。n个= 4; 观察到约25个细胞的非靶向控制（NTC）siRNA和网格蛋白siRNA，每个n。比例尺=15μm。**（F）**通过western blot证实，与对照siRNA相比，网格蛋白重链蛋白表达的变化约为0.27±0.065倍。**（G）**siRNA对Cav-1的消耗对HDL内化也没有影响。n个= 4; 观察到约40个细胞的非靶向控制（NTC）siRNA和网格蛋白siRNA，每个n。比例尺=15μm。**（H）**通过蛋白质印迹证实了Cav-1缺失，其显示与对照siRNA相比，Cav-1蛋白表达的变化约为0.29±0.027倍。^*第页< 0.05;^**第页< 0.005;^***第页< 0.0001.

图3
用于量化HDL细胞转化的单细胞分析。**（A）**TIRF分析示意图。将荧光标记的HDL添加到HCCMEC融合单层的顶部表面，并在其进入细胞底部的光照场时通过TIRF显微镜进行检测。**（B）**TIRF代表视频中的静态图像。白色箭头表示不融合的小泡，而红色箭头表示含有HDL的小泡在胞吐过程中消失。比例尺=0.60μm。**（C）**使用Dyngo4a预处理30分钟或在允许HDL与心尖膜结合后添加N-乙基马来酰亚胺（NEM）均减少了HDL细胞转移事件的数量。n个=6（对于Dyngo4a和n个对于NEM，=3；每个n细胞约有8个。**（D）**通过TIRF测量，40倍的过量未标记HDL在很大程度上消除了HDL转归。n个= 4; 每个n细胞约有8个。**（E）**高密度脂蛋白（HDL）转染是可饱和的。n个= 4; 每个n细胞约有8个。^**第页< 0.005,^***第页<0.0001与对照组。

图4
清除剂受体BI与HDL共存，但不存在于耐洗涤剂膜中**（A）**在37°C下添加Alexa 568-HDL（白色箭头）5分钟后，对内源性SR-BI（绿色）进行免疫染色。合并图像中的白色箭头表示共定位区域；HDL与SR-BI的曼德斯系数=0.247。n个= 3; 每个n观察到大约24个细胞。与偶然观察到的共定位（即HDL ROI旋转180°）相比。**（B）**标记细胞表面SR-BI（绿色），并在37°C下孵育细胞30分钟。图像显示受体随时间内化（白色箭头）；顶端膜用凝集素（红色）染色。**（C）**HCCMEC裂解物的密度梯度分级显示，内源性SR-BI随VE-cadherin亚组分（30–52.5%optiprep）迁移，而不从富含小窝蛋白-1的组分（20%optiprep）中迁移。所示为代表性斑点；n个=4个实验。

图5
高密度脂蛋白内化需要SR-BI。**（A）**添加与SR-BI的细胞外结构域结合的未标记的抗SR-BI纳米体部分阻断HDL的内化。n个= 3; 每种情况下观察到约40个细胞。**（B）**将GFP和siRNA与SR-BI或非靶向对照（Ctrl）联合转染HCCMEC（摩尔比1:100），以测试SR-BI对HDL内化的影响。**（C）**转染48小时后，SR-BI siRNA转染细胞显示HDL内化减少。n个= 5; 每种情况下观察到大约25个转染细胞。比例尺=15μm。^*第页< 0.01.（D）免疫荧光（绿色为SR-BI，红色为mCherry）验证了联合转染细胞中SR-BI的有效敲除。

图6
在HCCMEC中HDL内化不需要PDZK1。**（A）**Western blot显示内源性PDZK1在HCCMEC中的表达与阳性对照相比，HCCMEC过度表达PDZK1。**（B）**单独转染GFP或GFP-PDZK1后48小时，DiI-HDL内化10分钟，这表明过度表达的GFP-PDZK1对DiI-HDL内化没有显著影响。量化可以在中找到**（C）**;n个= 5; 每种情况下观察到大约25个转染细胞。比例尺=15μm。

图7
抑制一氧化氮合酶并不影响HCCMEC的HDL内化。**（A）**NO供体非酸精胺显著增加了DAF荧光，证实了HCCMEC中的这种NO-传感器。n个= 5; 每个治疗组16个随机字段n个每幅图像约有100个细胞。**（B）**非酸精胺不影响HDL内化。n个= 5; 每个实验每个条件下至少检查40个细胞。**（C）**通过DAF-FM（HCCMEC，n个= 5; HAEC、，n个= 3.^**第页< 0.005,^*第页< 0.05),**（D）**L-NNA显著增加HCCMEC中HDL内化约2.5倍，但HAEC中仅增加1.4倍**（E）**（HCCMEC，n个= 5; HAEC、，n个= 3.^*第页< 0.05). 比例尺=15μm。

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