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.2017年11月20日；8(1):1627.
doi:10.1038/s41467-017-01560-x。

单细胞RNA谱分析法构建小鼠乳腺发育谱系关系

布宾德·帕尔 1 2, 陈云顺 2 三, 弗朗索瓦·维兰特 1 2, 保罗·杰米森 1, 拉维尼亚·戈登 4, 安妮·C·里奥斯 1 2, 斯蒂芬·威尔科克斯 5, 奈阳福（Naiyang Fu） 1 2, Kevin He Liu（凯文·何刘） 1, Felicity C千斤顶 1, 梅丽莎·戴维斯 三 6, 杰弗里·林德曼 1 7 8, 戈登·史密斯 三 9, 简·E·维斯瓦德 10 11
附属公司

单细胞RNA谱分析法构建小鼠乳腺发育谱系关系

Bhupinder帕尔等。 国家公社. .

摘要

乳腺上皮由两个初级细胞谱系组成，但这些细胞室中的异质性程度及其在发育过程中的谱系关系仍然是一个悬而未决的问题。在这里，我们报告了跨越出生后腺体四个发育阶段的小鼠乳腺上皮细胞的单细胞RNA图谱。值得注意的是，上皮细胞经历了基因表达的大规模转变，从青春期前相对均匀的基底样程序转变为青春期不同的谱系限制程序。单细胞转录组的查询揭示了管腔和基底室中不同水平的多样性，并确定了以CD55标记的早期祖细胞亚群。此外，我们还发现了成年乳腺基底细胞中的管腔转运群和罕见的混合线团。这些发现共同指出了一个发育层次，即在明确不同谱系特征之前，在出生后早期腺体中普遍存在一个类似于基底的基因表达程序，并且存在可能充当转运或谱系提呈细胞的细胞中间产物。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1
青春期乳腺上皮分子异质性的获得。一青春期前（2周；红色）、青春期（5周；绿色，TEB为深绿色）和成年期（10周；黑色）的乳腺示意图。b条scRNA-seq谱的多维标度图。在青春期前、青春期和成年期收集总上皮细胞，并使用Fluidigm C1平台进行分析。图上的距离对应于单元格之间的对数倍变化。第一个打印维度(x个-轴）将青春期前的细胞与青春期或成年腺体中的细胞明显分开。青春期前，12只小鼠；青春期，6只小鼠；成年，每种4只；三个独立的实验。c（c）相同460个单细胞的基因表达热图b条行对应于跨越三个发育阶段的前500个DE基因。列对应于按阶段着色的单元格，如一和b条，由顶部的条表示。侧栏中突出显示了主要基因簇I至VI；补充表2列出了这些簇中的基因。所选基因显示为簇I、簇II和簇IV，包含在2周时特异表达的基因。热图值是按行缩放的对数表达式（红色=高表达式；蓝色=低表达）。d日显示选定基因在三个发育阶段的相对表达的三元图。对于每个基因，在每个阶段对所有细胞的表达进行平均。大多数已知的腔特异性（紫色）基因在5周龄和10周龄腺体的细胞中强烈上调，而不同的基底特异性基因（天蓝色）在不同的发育阶段表达。基因对应于Fu等人2015年的前1000个DE基因。电子小提琴图显示了每个细胞发育阶段所选基因的基因表达。纵轴表示为log2-RPKM
图2
图2
大多数青春期前上皮细胞表现出独特的基底样特征。一免疫标记角蛋白14（绿色）、波形蛋白（红色）和角蛋白8/18（蓝色）的完整乳腺导管树的整体安装共焦3D图像（顶部面板）和光学部分（中部和底部面板）。在2周龄（左侧面板）和9周龄（右侧面板）时收集乳腺。比例尺，200µm（顶部面板）；20µm（底板）(n个 = 每个时间点3只老鼠）。基底细胞/肌细胞表示外层的基底细胞/肌上皮细胞。b条基于scRNA-seq图谱的差异表达分析，基因本体术语在2周和5周的上皮细胞中上调。c（c）基因本体术语在2周和10周的上皮细胞中上调。d日在2周和10周的上皮细胞中KEGG通路上调。电子基因本体术语在5周和10周时下调。（f）与青春期相关的青春期前细胞中选定基因的蛋白质相互作用子网络上调（红色）。节点形状代表蛋白质功能（圆圈=信号转导；square=转录因子；圆角方形=对偶函数，三角形=以上均无）。克相对于青春期，青春期前细胞中选定基因的蛋白质相互作用亚网络下调（绿色）
图3
图3
青春期和成年乳腺中多个亚群的鉴定。一热图显示了来自青春期（绿色）和成年（黑色）乳腺的343个上皮细胞基于其谱系特异性基因的表达的分级聚类（200个基底基因和200个管腔基因；见补充表3）。列对应于按阶段着色的单元格，由顶部的条表示。所示细胞与图1b、c和补充图1b和c中的5周龄和10周龄细胞相同。显示了七个主要细胞簇（基因列表见补充表4）。基本基因=蓝色；管腔基因=紫色；红色=高表达；蓝色=低表达。b条scRNA-seq谱的多维标度图。这些与图1b中的相同，但细胞表达55加元（RPKM>40）高亮显示为蓝色三角形。55加元 +细胞在所有三个阶段都存在，但青春期前的腺体只有罕见的细胞（图中圈出）。c（c）青春期前（2周）（左）、青春期（5周）（中）和成人（10周）（右）乳腺分离的上皮亚群中CD55的表达。Lin中CD29与CD24表达的代表性点图——细胞（参见补充图3中的选通策略）显示在左侧，而CD29与CD55在管腔（顶部）或基底（底部）的表达则显示在右侧(n个 = 每个时间点3个独立实验：青春期前每个实验12只小鼠，青春期每个实验6只小鼠，成人每个实验4只小鼠）。d日新分选Lin的CD14/CD55流式细胞术图——CD29型洛CD24型+从10周龄FVB/N小鼠（代表5个独立实验，每个实验4只小鼠）分离的（腔）乳腺上皮细胞。电子76个纯化管腔细胞的分层聚类55加元和抄送14基因表达（Fluidigm C1平台；参见补充图4c）。红色=高表达；蓝色=低表达。（f）CD14的克隆形成活性——CD55型——，CD14——CD55型+，CD14+CD55型——和CD14+CD55型+管腔（CD29洛CD24型+)来自10周龄FVB/N小鼠的亚群，在Matrigel中铺板（每个群体1000个细胞）。三个独立实验的代表，每个实验4只小鼠。P（P）-值（未配对t吨-试验）<0.0001。比例尺；1000微米
图4
图4
3308个成人总上皮细胞的转录组分析显示存在管腔中间簇。一成人乳腺总上皮细胞转录本的t-SNE图(n个 = 4只小鼠）。如图所示，主要簇可鉴定为基底（簇#1249细胞）、管腔前体（LP；簇#2，667细胞）、成熟管腔（ML；簇#3，1057细胞），管腔中间物（簇#4，166细胞）和簇#5（绿色，125细胞）。b条根据已知的这些细胞类型的谱系特异性特征，三元图将单个上皮细胞分为基底细胞、LP细胞和ML细胞簇。细胞是根据它们表达的三种细胞类型特有的基因的相对比例绘制的。该分析还显示LP和ML细胞之间存在Lum-Int簇（紫色细胞）。c（c）检查上皮细胞簇的典型基底基因和管腔基因的表达，以确定它们在细胞簇中的模式。颜色表示log2-CPM中的表达水平
图5
图5
成人腺体中纯化的基底上皮细胞包含一个谱系周期亚群。一热图显示145个分类的基底上皮细胞（Lin——CD29型你好CD24型+)从Fluidigm C1平台捕获的成人乳腺（红色=高表达，蓝色=低表达）(n个 = 4只小鼠）。混合线性中间电池标记在盒子里。b条96种成人基底细胞qRT-PCR表达的热图(n个 = 6只小鼠；4个独立实验）。使用Fluidigm Biomark多重qPCR平台对13个基础基因和11个管腔谱系基因进行Taqman分析。颜色键显示从黑色（Ct>40，无表达式）到黄色（最高表达式）的Ct值。同时表达基底基因和管腔基因的混合谱系细胞用橙色条标记
图6
图6
对发情期和发情期成体上皮细胞的转录组分析揭示了分子异质性的特定变化。一总上皮细胞转录体的t-SNE图（Lin——CD24型+;n个 = 使用10X Genomics Chromium平台（顶部面板）从发情期（2729个细胞）和间期（2439个细胞）的成年乳腺中产生2只小鼠。代表基底成熟管腔（ML）和管腔前体（LP）细胞群的主要上皮簇（1-3；见右图）可通过基于这些细胞类型已知谱系特异性特征的三元图进行识别（底图）。细胞是根据它们表达的三种细胞类型特有的基因的相对比例绘制的。第4组描述了Lum Int（腔中间）种群。b条三元图一但以细胞周期基因表达为标志的细胞。标记为红色的细胞属于补充图7中确定的细胞周期上调的细胞簇。c（c）热图显示了所有发情期（绿色）和间期（红色）上皮细胞根据其谱系特异性特征基因（200个DE基底基因和200个DE-管腔基因）的表达进行的层次聚类。在间期特异上调的管腔和基础基因簇在侧柱中用方框标记（基础基因=蓝色；管腔基因=紫色；红色=高表达；蓝色=低表达）
图7
图7
描述乳腺个体发育期间谱系关系和分子和细胞异质性增加的示意图模型。一在青春期前和青春期开始之间，基因表达发生了深刻的变化。新发现的中间簇包括一个管腔中间簇（Lum-Int）种群和一个混合线性或“谱系-时间”子集。Lum-Int在LP和ML之间的中间水平表达管腔基因，但少数基因（四个显示）的平均表达至少高出20%。CD55型+具有中间性质的细胞在青春期很容易检测到，在发育过程中局限于管腔谱系。b条沿上皮层次新识别簇的建议位置。基底隔室内的混合线亚群可能代表着向管腔谱系转化之前的短暂种群。分子证据表明，Lum-Int簇位于管腔前体细胞和成熟导管/肺泡细胞之间
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参考文献

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