PARP1 changes from three-dimensional DNA damage searching to one-dimensional diffusion after auto-PARylation or in the presence of APE1

doi:10.1093/nar/gkx1047

.2017年12月15日；45(22):12834-12847.

doi:10.1093/nar/gkx1047。

自PARP1化或APE1存在时PARP1从三维DNA损伤搜索变为一维扩散

附属公司

¹匹兹堡大学药理学和化学生物学系，匹兹堡，PA 15213，美国。
²匹兹堡大学癌症研究所，希尔曼癌症中心，匹兹堡，宾夕法尼亚州15213，美国。
^三美国北卡罗来纳州27709三角研究园NIH国家环境健康科学研究所基因组完整性和结构生物学实验室。
⁴美国纽约州萨拉托加斯普林斯斯斯基德莫尔学院化学系，邮编12866。
⁵美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学生物成像中心，邮编15261。

PMID： 29121337
预防性维修识别码：项目经理5728402
内政部： 10.1093/nar/gkx1047

自PARP1化或APE1存在时PARP1从三维DNA损伤搜索变为一维扩散

Lili Liu（刘丽丽）等。核酸研究. 2017.

.2017年12月15日；45(22):12834-12847.

doi:10.1093/nar/gkx1047。

附属公司

¹匹兹堡大学药理学和化学生物学系，匹兹堡，PA 15213，美国。
²匹兹堡大学癌症研究所，希尔曼癌症中心，匹兹堡，宾夕法尼亚州15213，美国。
^三美国北卡罗来纳州27709三角研究园NIH国家环境健康科学研究所基因组完整性和结构生物学实验室。
⁴美国纽约州萨拉托加斯普林斯斯斯基德莫尔学院化学系，邮编12866。
⁵美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学生物成像中心，邮编15261。

PMID： 29121337
预防性维修识别码：项目经理5728402
内政部： 10.1093/nar/gkx1047

摘要

PARP1依赖性聚腺苷二磷酸核糖基化（PARylization）参与多种形式DNA损伤的修复。在这里，我们使用原子力显微镜（AFM）和单分子荧光显微镜检查PARP1与常见DNA修复中间体的相互作用。AFM体积分析表明，PARP1在缺口、碱性（AP）位点与DNA结合，并以单体形式结束。在AP DNA损伤阵列上，采用单分子DNA张力试验跟踪在AP内切酶（APE1）缺失和存在的情况下PARP1的实时动态行为。这些实验表明，PARP1主要通过三维扩散进行损伤搜索。研究发现，APE1与DNA上的PARP1共定域能够诱导非运动PARP1的一维扩散，而过量的APE1也促进了DNA结合PARP1解离。此外，PARP1的自PARP1化使蛋白质通过线性扩散增加3倍来改变其损伤搜索策略。最后，我们证明PARP抑制剂olaparib并没有显著改变PARP1从DNA中分离的速率，而是导致了与DNA结合的PARP1分子的运动性增强。

©作者2017。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。

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数字

**图1。**
PARP1以单体形式与碱性位点和DNA末端结合。(A类)PARP1与538 bp DNA片段结合的AFM图像的三维视图，该DNA片段具有30%等高线长度的碱基（AP）位点（AP538）。红色箭头表示DNA-bound PARP1，青色箭头表示空闲PARP1和白色箭头表示空闲BSA。扫描区域1μm×1μm。(B类)AP538上PARP1的结束与内部绑定事件条形图(N个= 273). (C类)沿着AP538的PARP1内部结合位置直方图(N个= 136). 实心曲线表示分布数据的高斯拟合，以. (天)和(E类)DNA末端结合PARP1的体积分布直方图(N个=126）和AP站点(N个=113）。实心曲线表示数据的高斯拟合。黑色箭头表示预期二聚体体积峰（451 nm）的位置^三). 用于端部装订(天)，拟合曲线的中心位于，对应于分子量用于AP站点的特定绑定（20%到40%之间）(E类)，拟合曲线的中心位于对应于分子量单体His-MBP-TEV-PARP1的预测分子量为.

公式图像 — **图1。**
PARP1以单体形式与碱性位点和DNA末端结合。(A类)PARP1与538 bp DNA片段结合的AFM图像的三维视图，该DNA片段具有30%等高线长度的碱基（AP）位点（AP538）。红色箭头表示DNA-bound PARP1，青色箭头表示空闲PARP1和白色箭头表示空闲BSA。扫描区域1μm×1μm。(B类)AP538上PARP1的结束与内部绑定事件条形图(N个= 273). (C类)沿着AP538的PARP1内部结合位置直方图(N个= 136). 实心曲线表示分布数据的高斯拟合，以. (天)和(E类)DNA末端结合PARP1的体积分布直方图(N个=126）和AP站点(N个=113）。实心曲线表示数据的高斯拟合。黑色箭头表示预期二聚体体积峰（451 nm）的位置^三). 用于端部装订(天)，拟合曲线的中心位于，对应于分子量用于AP站点的特定绑定（20%到40%之间）(E类)，拟合曲线的中心位于对应于分子量单体His-MBP-TEV-PARP1的预测分子量为.

**图2。**
PARP1特异性地结合到嵌入在长DNA底物中的碱基位点阵列。(A类)DNA绳索试验示意图。将在特定位置具有AP位点的长DNA底物悬浮在5μm聚赖氨酸涂层的二氧化硅珠之间。这些损伤部位可以通过相邻的生物素被链霉亲和素（SA）Qdot（红点）标记，或者被标记的DNA修复蛋白（绿点）识别。蛋白质和病变的共定标显示为靠近位置的红点和绿点周围的黄色辉光。(B类)通过抗体三明治标记His-MBP-TEV-PARP1（见补充信息）。PARP1域的颜色如下：锌指1、2和3分别为绿色、浅灰色和蓝色；黑色BRCT；WGR为红色；小麦中的HD；和ART为深黄色。(C类)含有特定AP位点的长DNA底物上PARP1蛋白阵列的静止视频帧和波形图。白色圆圈勾勒出了硅珠的位置。星号标记解离粒子。水平和垂直比例尺分别表示5 s和2 kp。(天)Qdot605-mHisAB-PARP1（红色）绑定到SA-Qdot655标记的AP-BiodT站点（绿色）的静止视频帧和波形图。颜色编码的红色、绿色和黄色箭头在适当的地方突出显示这些绑定事件。水平和垂直比例尺分别表示50 s和2 kb。(E类)双色分析中AP-BiodT DNA紧索上Qdot标记的AP-Biod位点（红色）与Qdot标签的PARP1（绿色）的共标度（黄色）文氏图(N个= 208). (F类)DNA中标记的AP-BiodT位点之间的成对距离分布（白色，N个=231，顶部），在AP DNA上标记为PARP1（橙色，N个=26，中间），并在AP-BiodT DNA上标记PARP1（蓝色，N个=28，底部）。实心黑色曲线表示对标记的AP-BiodT站点的距离分布进行高斯拟合。

**图3。**
PARP1在含有碱基位点的DNA上的动态行为。(A类)显示含有AP位点的DNA上PARP1行为的条形图(N个= 129,**M（M）**：可移动，天：分离，并购：运动和分离）。三个独立实验的数据显示为加权平均值±SEM。活动人口(**M（M）**)包括DNA上所有三种运动类型的蛋白质颗粒（随机、受限和暂停）。(B类)显示PARP1四种不同类型运动的Kymograph：（I）随机，（II）受限，（III）暂停，和（IV）非运动。水平和垂直比例尺分别表示5秒和2 kbp。(C类)显示AP DNA上PARP1运动类型的条形图。三个独立实验的数据显示为加权平均值±SEM。请注意，y轴在10%和80%之间断裂。(天)PARP1异常扩散指数（α因子）与扩散系数（log）的关系图₁₀D） ●●●●。

**图4。**
PARP1和APE1在含有APE1的DNA处理碱基位点上的相互作用。(A类)在没有APE1处理的AP DNA上，PARP1（绿色）与APE1（红色）的共定标（黄色）文氏图(左边)和存在(*中间的*)在没有NAD的情况下，未处理的AP DNA上的NAD和带有mAPE1（红色）的PARP1（绿色）(*正确的*). (B类)显示APE1存在时PARP1行为的条形图（深绿色，N个=89）、APE1和NAD（绿色，N个=47）和mAPE1（浅绿色，N个= 84). 流动人口(**M（M）**)包括DNA上所有三种运动类型的蛋白质颗粒（随机、受限和暂停）。(C类)显示APE1行为的条形图（红色，N个=44）和mAPE1（浅粉红色，N个=63）在PARP1在场的情况下(**M（M）**：可移动，天：未关联）。流动人口(**M（M）**)包括DNA上所有三种运动类型的蛋白质颗粒（随机、受限和暂停）。(天)NAD存在时共定位PARP1（绿色）和APE1（红色）的钾谱图。(E类)共定位PARP1（绿色）和mAPE1（红色）的钾谱图。水平和垂直比例尺分别表示50 s和2 kb。

**图5。**
PARP1的自PARP1化增加其在APE1处理的碱性DNA上的运动。(A类)蛋白质印迹*在体外*使用37 bp双链DNA作为PARP1激活底物的自PARP1分析。(B类)显示PARP1的行为的条形图（青色，N个=118），自动修改PARP1在体外自PARylation反应（AM-PARP1，紫色，N个=126），高度修饰的PARP1（HM-PARP1，橙色，N个=27），以及在奥拉帕林（PARP1+olaparib，灰色，N个= 112). 三个独立实验的数据显示为加权平均值±SEM(**M（M）**：动机，天：分离，**M&D公司**：运动和分离）。流动人口(**M（M）**)包括DNA上所有三种运动类型的蛋白质颗粒（随机、受限和暂停）。学生的吨-测试用于测试PARP1（对照组，用#表示）与AM-PARP1、HM-PARPI或PARP1+olaparib之间行为差异的统计显著性(***P（P）*< 0.005). (C类)异常扩散指数（α因子）与扩散系数（log）的关系图₁₀D）对于PARP1（青色，N个=8），AM-PARP1（紫色，N个=40）和HM-PARP1（橙色，N个= 11). (天)条形图显示了在olaparib存在的情况下PARP1、AM-PARP1、HM-PARP1和PARP1的运动类型(E类)异常扩散指数（α因子）与扩散系数（对数）的关系图₁₀D） AP DNA上的PARP1（红色，N个=25）和缺席（蓝色，N个=12）。无olaparib的数据从图3D重新绘制。静态电影帧(顶部)和日程表(底部)APE1处理的AP DNA上的AM-PARP1(F类)在奥拉帕林存在下，AP DNA上的PARP1和PARP1(**G公司**). 电影帧和日程表中的相应粒子如标签所示。

**图6。**
修复中间产物PARP1和APE1动力学的工作模型PARP1（与图2B相同的颜色方案）和APE1（紫色）识别AP位点的模型。详见正文。

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1. Benjamin R.C.，Gill D.M.，由受损DNA编程的体外聚（ADP-核糖）合成。含有不同类型断链的DNA分子的比较。生物学杂志。化学。1980; 255:10502–10508.-公共医学
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[5] Benjamin R.C.，Gill D.M.，由受损DNA编程的体外聚（ADP-核糖）合成。含有不同类型断链的DNA分子的比较。生物学杂志。化学。1980; 255:10502–10508.-公共医学

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