The open architecture of HD-PTP phosphatase provides new insights into the mechanism of regulation of ESCRT function

doi:10.1038/s41598-017-09467-9

.2017年8月22日；7(1):9151.

doi:10.1038/s41598-017-09467-9。

HD-PTP磷酸酶的开放结构为ESCRT功能的调节机制提供了新的见解

Deepankar Gahloth公司¹, 格雷厄姆天堂², 托马斯·乔维特^1 三, 保罗模具^1 三, 乔迪·贝拉¹, 克莱尔·巴尔多克¹, 菲利普·伍德曼¹, 利迪亚·塔伯内罗⁴

附属公司

¹英国曼彻斯特大学生物医学与健康学院生物科学学院，曼彻斯特学术健康科学中心。
²英国曼彻斯特大学化学与光子科学学院。
^三英国曼彻斯特大学生物医学与健康学院生物分子分析核心设施，曼彻斯特学术健康科学中心。
⁴英国曼彻斯特大学生物医学与健康学院生物科学学院，曼彻斯特学术健康科学中心。lydia.tabernerero@manchester.ac.uk。

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HD-PTP磷酸酶的开放结构为ESCRT功能的调节机制提供了新的见解

Deepankar Gahloth公司等。科学代表. 2017.

.2017年8月22日；7(1):9151.

doi:10.1038/s41598-017-09467-9。

作者

Deepankar Gahloth公司¹, 格雷厄姆天堂², 托马斯·乔维特^1 三, 保罗模具^1 三, 乔迪·贝拉¹, 克莱尔·巴尔多克¹, 菲利普·伍德曼¹, 利迪亚·塔伯内罗⁴

附属公司

¹英国曼彻斯特大学生物医学与健康学院生物科学学院，曼彻斯特学术健康科学中心。
²英国曼彻斯特大学化学与光子科学学院。
^三英国曼彻斯特大学生物医学与健康学院生物分子分析核心设施，曼彻斯特学术健康科学中心。
⁴英国曼彻斯特大学生物医学与健康学院生物科学学院，曼彻斯特学术健康科学中心。lydia.tabernerero@manchester.ac.uk。

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摘要

HD-PTP是一种肿瘤抑制性磷酸酶，控制细胞内吞、有丝分裂受体的下调和细胞迁移。其作用的核心是运输所需的关键内体分选复合物（ESCRT）的特定补充。然而，使HD-PTP调节ESCRT功能的分子机制尚不清楚。我们使用小角度X射线散射和流体力学分析表征了HD-PTP的整个ESCRT结合区的分子结构。我们表明，HD-PTP采用开放和扩展构象，最适合与多个ESCRT的伴随相互作用，这与相关ESCRT调节器Alix的紧凑构象形成对比。我们证明HD-PTP开放构象在功能上能够与细胞蛋白结合。我们的分析使HD-PTP与ESCRT-0、ESCRT-I和ESCRT-III的功能合作合理化，并支持通过ESCRT亚基置换来调节ESCRT功能的模型，这对于确定泛素化货物的命运至关重要。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
HD-PTP和Alix的域组织。残数表示域边界，箭头表示不同交互伙伴的绑定位置。域名：Bro1；CC，线圈；PRR，富含脯氨酸区域；蛋白酪氨酸磷酸酶；PEST富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、丝氨酸（S）和苏氨酸（T）。HD-PTP中PRR的近端区域显示为棕色框（残基714-738）。

图2
用小角度X射线散射分析HD-PTP(A类–C类)X射线散射强度对数（I（q））与散射矢量q（Au）的函数关系图⁻¹)用于HD-PTP_{科科斯群岛} **（A）**)、HD-PTP_{浏览器1-CC}(B类)和HD-PTP_{浏览器1-CC-PRR}(C类). SAXS数据显示为灰色开圆圈，最佳个体分子模型的归一化拟合显示为红线（用FoXS计算，拟合优度用χ表示²值）。*从头算*使用DAMAVER计算的重建显示为透明封套，其中使用Chimera中的自动地图拟合工具叠加了最佳单个模型。HD-PTP的N端尾部_{浏览器1-CC}和HD-PTP_{浏览器1-CC-PRR}为清晰起见，未显示。(D类)HD-PTP拟合优度（χ）的变化_{科科斯群岛}SAXS数据是子域CC1和CC2（dCC1-CC2）质心之间距离的函数。HD-PTP晶体结构坐标拟合_{科科斯群岛}（蓝色）和Alix_V（V）（灰色，闭合表单；绿色，打开表单）分别显示（显示选定的PDB ID代码）。适用于HD-PTP_{科科斯群岛}具有不同CC1-CC2距离的模型显示为红色三角形。填充三角形对应于计算的沉降系数（SOMO）与实验观测值一致的模型（表1）。对于扩展形式，观察到最佳χ值并与水动力数据一致。

图3
HD-PTP的流体动力学分析。(A类)HD-PTP的SEC-MALS剖面_{科科斯群岛}、HD-PTP_{浏览器1-CC}和HD-PTP_{浏览器1-CC-PRR}色谱图显示了微分折射率（归一化）和分子量与洗脱体积的关系。洗脱曲线显示单峰，表示单分散样品。HD-PTP的平均分子量为38kDa_{科科斯群岛}HD-PTP为86 kDa_{浏览器1-CC}HD-PTP为88_{浏览器1-CC-PRR}指出每个蛋白质的单体颗粒。(B类)HD-PTP的AUC衍生沉降系数分布_{科科斯群岛}、HD-PTP_{浏览器1-CC}和HD-PTP_{浏览器1-CC-PRR}显示每个构造的单个峰值，并用相应的缓冲区校正标记*S公司* _20，宽值。其他水动力参数如表1所示。

图4
HD-PTP和Alix的分子形状不同。(A类)HD-PTP最佳个体模型的叠加_{浏览器1-CC}（红色）具有Alix晶体结构_浏览器1-V（紫色）（PDB ID 2OEV）显示HD-PTP的开放和扩展结构与Alix的更紧密构象之间的对比。**（B）**HD-PTP带状图_Bro1抄送ESCRT亚单位STAM2（青色）、CHMP4B（绿色）和UBAP1（绿色）的叠加模型结合到各自的结合位点^,箭头表示结合部位之间的近似距离。

图5
分析HD-PTP与ESCRT亚单位的结合。(A类)固定化全长CHMP4B与HD-PTP的平衡生物传感器结合分析_兄弟1(*K（K）* _d日4.88±0.3μM）和HD-PTP_{浏览器1-CC-PRR}(*K（K）* _d日1.1±0.1μM），生物传感器传感器图如插图所示。**（B）**固定化HD-PTP的平衡生物传感器结合分析_{浏览器1-CC-PRR}合成CHMP4B肽(*K（K）* _d日30.9±0.2μM）和UBAP1肽(*K（K）* _d日57.5±3.1μM）。生物传感器传感器图如插图所示。

图6
HD-PTP是ESCRT绑定的脚手架。我们的ESCRT功能的HD-PTP调节模型涉及在体内运输泛素化货物期间不同ESCRT的协同结合和置换。首先，在激活的EGFR内部化后，泛素化的货物流量进入ESCRT-0。在第1阶段，ESCRT-0亚单位STAM2通过其在Bro1结构域的GAT结构域（粉红色椭圆形）和在PRR的SH3结构域（粉色圆圈）结合HD-PTP（结合到SH3共识肽，*PPRPTAPKP公司*). 在第2阶段，STAM2/ESTRT-0从HD-PTP中释放_{项目风险审查}通过ESCRT-I核心亚单位TSG101，允许UBAP1进入CC区域，并使ESCRT-I-与HD-PTP稳定结合。UBAP1与CC域中的保守区域FYX2 L（黄色）结合，TSG101与SH3共识中的“PTAP”基序（绿色）结合。在第3阶段，ESCRT-III（C4:CHMP4亚基，紫色）与HD-PTP的Bro1结构域的结合进一步取代ESCRT-0，将货物推入MVB途径。其他因素，包括去平衡酶的存在和ESCRT-III聚合，也会推动MVB分类。

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