Combination Treatment with Orlistat-Containing Nanoparticles and Taxanes Is Synergistic and Enhances Microtubule Stability in Taxane-Resistant Prostate Cancer Cells

doi:10.1158/1535-7163.MCT-17-0013

.2017年9月；16(9):1819-1830.

doi:10.1158/1535-7163.MCT-17-0013。 Epub 2017年6月14日。

含奥利司他纳米粒子和紫杉烷的联合治疗具有协同作用并增强紫杉烷耐药前列腺癌细胞的微管稳定性

附属公司

¹内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系。
²北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆威克森林大学健康科学系癌症生物学系。
^三内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Eppley癌症及相关疾病研究所。
⁴内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心生物化学和分子生物学系。
⁵内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心遗传学、细胞生物学和解剖学系。
⁶内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心病理学和微生物学系。
⁷弗雷德和帕梅拉·巴菲特癌症中心，内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心。
⁸北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆威克森林大学健康科学部威克森林综合癌症中心。
⁹内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系。aaron.mohs@unmc.edu。

PMID： 28615298
预防性维修识别码：项目编号：C5598554
内政部： 10.1158/1535-7163.MCT-17-0013

含奥利司他纳米粒子和紫杉烷的联合治疗具有协同作用并增强紫杉烷耐药前列腺癌细胞的微管稳定性

约书亚·J·苏切克等。摩尔癌症治疗. 2017年9月.

.2017年9月；16(9):1819-1830.

doi:10.1158/1535-7163.MCT-17-0013。 Epub 2017年6月14日。

附属公司

¹内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系。
²北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆威克森林大学健康科学系癌症生物学系。
^三内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Eppley癌症及相关疾病研究所。
⁴内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心生物化学和分子生物学系。
⁵内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心遗传学、细胞生物学和解剖学系。
⁶内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心病理学和微生物学系。
⁷弗雷德和帕梅拉·巴菲特癌症中心，内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心。
⁸北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆威克森林大学健康科学部威克森林综合癌症中心。
⁹内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系。aaron.mohs@unmc.edu。

PMID： 28615298
预防性维修识别码：项目编号：C5598554
内政部： 10.1158/1535-7163.MCT-17-0013

摘要

基于紫杉醇的治疗为转移性前列腺癌患者提供了生存益处，但在这种情况下，中位生存期不到20个月，部分原因是紫杉醇相关耐药性。需要创新策略来克服化疗耐药性，以提高患者生存率。在这里，利用两个已建立的紫杉醇耐药（TxR）细胞系，研究了FDA批准的药物奥利司他（orlistat）的新实验纳米制剂NanoOrl对紫杉醇耐药性前列腺癌的细胞毒性。奥利司他是一种抑制胃脂肪酶的减肥药，也是脂肪酸合成酶（FASN）的有效抑制剂，FASN在多种癌症中过度表达。还研究了NanoOrl在TxR细胞系中与紫杉烷协同作用的潜力。在PC3-TxR和DU145-TxR细胞中，奥利司他和NanoOrl与紫杉醇、多西紫杉醇和卡巴唑醇联合使用时，两者协同抑制细胞活力，但这些组合在亲本系中也是加性的。我们观察到NanoOrl和多西紫杉醇联合治疗的TxR细胞的协同凋亡水平。从机制上讲，奥利司他和紫杉烷之间的协同作用与P-糖蛋白多药耐药蛋白的作用无关，这是通过外排活性测定确定的。另一方面，免疫印迹和抗去甲酪氨酸微管蛋白抗体的免疫荧光染色表明，NanoOrl和多西紫杉醇联合处理TxR细胞可诱导微管稳定性增强。此外，TxR细胞表现出更高的脂质合成，如¹⁴被NanoOrl废除的C-胆碱掺入。这些结果为评估NanoOrl克服紫杉烷抗性的转化潜力提供了有力的理论依据。摩尔癌症疗法；16(9); 1819-30. ©2017 AACR版权所有.

PubMed免责声明

数字

**图1。对奥利司他和NanoOrl的紫杉醇耐药性和敏感性的确认**
**（A）**用全细胞蛋白裂解物的免疫印迹法评估蛋白质表达。提供了相对于母细胞的β-微管蛋白水平的定量。(B）用空NP或NanoOrl（50μM）处理细胞24小时。用1μCi[甲基]脉冲细胞-¹⁴C] 氯化胆碱2小时和¹⁴C-胆碱掺入脂质通过闪烁计数进行量化，并归一化为蛋白质浓度。数值表示为三个单独实验的平均值±标准差*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；通过ANOVA和Tukey方法进行多重比较确定。**C–H型**用指定浓度的紫杉烷[紫杉醇]处理亲本PC3和DU145或紫杉醇耐药PC3-TxR和DU145-TxR细胞**（C）**，多西紫杉醇**（D）**，或卡巴唑醇**（E）**]，奥利斯特**（F）**、NanoOrl（G），或空纳米粒子**（H）**.N个=每个处理6个技术重复。72小时后，用CCK-8法评估细胞活力。细胞活力数据标准化为每个板上未经处理的对照孔。

**图2。Nano-Oristat降低IC₅₀紫杉烷耐药前列腺癌细胞中紫杉烷的含量**
用8种浓度的**（A）**紫杉醇，**（B）**多西他赛，和**（C）**cabazitaxel和7个浓度的NanoOrl。N个=每个组合重复6次。72小时后，用CCK-8法评估细胞活力。每个点表示计算的IC₅₀所示紫杉烷值作为NanoOrl浓度的函数，误差线代表95%的置信区间。由于95%置信区间的范围很小，一些误差条不可见。

**图3。奥利司他或NanoOrl与紫杉烷的组合在母细胞中是加性的，在紫杉烷抗性细胞中是协同的**
**（A）**如图2所示，用指定的浓度（x轴以上的紫杉烷浓度、y轴上的奥利司他或NanoOrl浓度）处理细胞，并用CCK-8测定法进行评估。细胞活力数据标准化为每个板上未经处理的对照孔。使用Combenefit软件分析了协同效应。结果显示了Bliss模型协同/对抗计算协同分数的“轮廓”视图（预测的相加性和观察到的生存能力之间的差异）。显著的协同作用用深蓝色区域表示，协同作用得分高于25和50的区域被标记。条形图显示了观察到的单个试剂和组合相对活性（暗条）的两个示例，以及Bliss模型预测的相加性（棋盘格条）**（B）**PC3-TxR和**（C）**PC3细胞。**（D）**如图2和3A所示处理细胞，并使用CompuSyn软件分析归一化数据的协同作用。结果表明，协同/拮抗作用在y轴上绘制为Log（组合指数）[Log（CI）]，而在x轴上绘制的是受影响分数（Fa）。CI值<1的组合是协同的，绘制在水平线下方；CI值=1的组合是相加的，绘制于水平线之上或附近；CI值>1的组合表示对抗，绘制在横线上方。用所示药物治疗的每个细胞系的CI<1组合百分比用*标记。

**图4。奥利司他或NanoOrl联合多西紫杉醇诱导细胞凋亡**
PC3-TxR型**（A）**和DU145-TxR电池**（B）**按照指示处理，并使用FITC-Annexin V凋亡检测试剂盒I（BD Biosciences）用AnnexinV-FITC和碘化丙啶（PI）染色，并用流式细胞仪定量。显示了每个处理的典型散点图。(**C–F）**早期凋亡百分比（Annexin V+/PI-；**C和E**)和晚期凋亡/坏死（Annexin V+/PI+；**D和F**)细胞被量化（n=3个技术重复）。数值表示为平均值±标准差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；通过ANOVA和Tukey方法进行多重比较确定。PC3 TxR信元(**G公司**)处理24小时和DU145-TxR细胞(我)使用Invitrogen CountessTM自动细胞计数器，通过台盼蓝排除法，在血细胞仪中对指定治疗进行48小时的治疗进行计数。数值用双尾Student t检验确定的平均值±s.d.P值表示*p≤0.05。PC3-TxR型**（H）**和DU145-TxR(J型)细胞按指示处理。通过免疫印迹分析指示蛋白的表达。

**图5。NanoOrl不影响MDR1活性，NanoOrl+多西紫杉醇联合使用可稳定紫杉醇耐药细胞中的微管**
30分钟后，使用Vybrant多药耐药检测试剂盒（Thermo Fisher）评估细胞中的MDR1活性**（A）**或4小时**（B）**使用指定浓度的奥利司他或NanoOrl进行治疗。用空纳米粒子（空NP，0.124 mg/mL）或维拉帕米（50μM）（一种MDR1抑制剂）处理细胞，作为阳性对照。用PBS洗涤后，用平板阅读器测量细胞荧光。数值表示为n=3个技术复制品的平均值±标准差。PC3-TxR型**（C）**或DU145-TxR电池**（D）**按指示处理。用PBS洗涤后，在RIPA缓冲液中收集全细胞蛋白裂解物，进行定量，并用免疫印迹法评估蛋白表达。脱酪氨酸-微管蛋白=脱酪氨酸的α-微管素（也称为Glu-微管肽）。将相同的裂解物放在单独的凝胶上，并用抗α-管蛋白抗体进行探测，以检查等载量。给出了与联合治疗相关的脱Tyr-Tubulin与α-Tubulin的比率。PC3公司**（E）**或PC3-TxR细胞**（F和G）**用200 nM多西紫杉醇（Doc）、12.5μM NanoOrl或指示的组合处理2.5 h。细胞用抗去甲肾上腺素微管抗体（绿色）、稳定微管标记物和DAPI（蓝色）染色。比例尺=20μm。(**H–I）**下表所示为两个独立孔中10个区域的每个细胞平均荧光强度±s.d.的量化*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；通过ANOVA和Tukey方法进行多重比较确定。

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