Dual Targeting of WEE1 and PLK1 by AZD1775 Elicits Single Agent Cellular Anticancer Activity

doi:10.1021/acschembio.7b00147

.2017年7月21日；12(7):1883-1892.

doi:10.1021/acschembio.7b00147。 Epub 2017年6月7日。

AZD1775双靶向WEE1和PLK1诱导单药细胞抗癌活性

附属公司

¹药物发现部，H.Lee Moffitt癌症中心和研究所，美国佛罗里达州坦帕市，邮编33612。
²癌症流行病学，H.Lee Moffitt癌症中心和研究所，美国佛罗里达州坦帕市，邮编33612。
^三化学生物学核心，H.Lee Moffitt癌症中心和研究所，美国佛罗里达州坦帕市，邮编33612。
⁴美国佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学癌症生物学博士项目，邮编：33620。
⁵美国佛罗里达州坦帕市H.Lee Moffitt癌症中心和研究所胸肿瘤科，邮编：33612。

PMID： 28557434
预防性维修识别码： PMC5551971
内政部： 10.1021/acschembio.7b00147

AZD1775双靶向WEE1和PLK1诱导单药细胞抗癌活性

加布里埃拉·赖特等。 ACS化学生物. 2017.

.2017年7月21日；12(7):1883-1892.

doi:10.1021/acschembio.7b00147。 Epub 2017年6月7日。

附属公司

¹美国佛罗里达州坦帕市H.Lee Moffitt癌症中心和研究所药物发现部，邮编：33612。
²癌症流行病学，H.Lee Moffitt癌症中心和研究所，美国佛罗里达州坦帕市，邮编33612。
^三化学生物学核心，H.Lee Moffitt癌症中心和研究所，美国佛罗里达州坦帕市，邮编33612。
⁴美国佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学癌症生物学博士项目，邮编：33620。
⁵美国佛罗里达州坦帕市H.Lee Moffitt癌症中心和研究所胸肿瘤科，邮编：33612。

PMID： 28557434
预防性维修识别码： PMC5551971
内政部： 10.1021/acschembio.7b00147

摘要

抑制WEE1酪氨酸激酶可增强抗癌化疗疗效。因此，WEE1抑制剂AZD1775（之前为MK-1775）目前正在癌症联合化疗的临床试验中进行评估。据报道，AZD1775具有高选择性，因此在许多研究中用作检测WEE1生物学的探针。然而，AZD1775作为单一药物也表现出抗癌活性，尽管其潜在机制尚不完全清楚。使用化学蛋白质组学方法，我们在这里描述了对肺癌细胞中AZD1775靶点的全蛋白质调查，并确定了除WEE1外的几个先前未知靶点。特别是，我们观察到polo-like kinase 1（PLK1）是AZD1775的新靶点。重要的是，体外激酶检测显示PLK1和WEE1被AZD1775以类似的效力抑制。随后使用RNAi对WEE1和PLK1进行的功能丧失实验表明，靶向PLK1可以增强通过WEE1敲除观察到的促凋亡和抗增殖作用。RNAi联合AZD1775治疗表明，WEE1和PLK1是介导AZD11775抗癌作用的最相关靶点。此外，CRISPR-Cas9对WEE1的破坏使H322肺癌细胞对AZD1775的敏感性与PLK1抑制剂BI-2536的强度相似，表明PLK1和WEE1之间存在复杂的串扰。总之，我们发现AZD1775是一种强效的WEE1和PLK1双重抑制剂，这限制了其作为WEE1特异性分子探针的用途。然而，PLK1的抑制对AZD1775的单药作用机制做出了重要贡献，并增强了其抗癌作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性金融利益

A.N.A.M.和U.R.是美国专利申请号15/125629（“PAXIP1作为WEE1抑制剂治疗的生物标记物”）的发明人。其他作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

**图1。AZD1775对非小细胞肺癌细胞的单药细胞抗癌活性**
（A） 72小时AZD1775处理对H322、A427、H1155和H1648非小细胞肺癌细胞和IC细胞活性影响的剂量-反应曲线₅₀活力抑制值。（B）对未经处理的H322和H1648细胞进行WEE1、CDK1和pY15 CDK1的免疫印迹分析。（C） 4h AZD1775（1μM）或顺铂（14μM）处理后H322和H1648细胞中γH2AX和总H2AX的免疫印迹分析。箭头表示未泛素化（~16 kDa）和单泛素化γH2AX。（D）免疫印迹分析用指示浓度的AZD1775或100 nM staurosporine（STS）处理48 h的H322和H1648细胞中的PARP1和caspase 3裂解。

**图2。AZD1775在H322非小细胞肺癌细胞中的靶向分布**
（A） AZD1775及其固定化类似物i-AZD177的化学结构。（B） H322细胞中AZD1775的蛋白激酶相互作用谱。蓝色方框突出显示了具有高光谱丰度（基于NSAF：归一化光谱丰度因子）和特异性（基于i-AZD1775亲和下拉和与未修改AZD11775的竞争实验之间光谱计数的倍数变化）的显著激酶目标候选物。蓝色节点表示NSAF高（>-7）的激酶，灰色节点表示NSAF低（<-7）。紫色光环表示具有细胞周期基因本体注释的激酶。（C） 100nM或1000nM AZD1775对已鉴定激酶的抑制*在体外*激酶分析（反应生物学）。（D） H322全细胞裂解物（WCL）中i-AZD1775亲和下拉列表（−）和AZD11775竞争下拉列表（+）的PLK1免疫印迹。（E） AZD1775抑制WEE1和PLK1的比较*在体外*激酶分析（Eurofins）。显示IC₅₀使用商业（CT:Chemietek）和内部合成（MCC:Moffitt癌症中心）AZD1775观察到的激酶值。（F）*生物信息学*基于PLK1与BI-2536，PDB:2RKU的X射线共晶结构，将AZD1775对接至PLK1。

**图3。H322细胞中WEE1和PLK1功能相关性的验证**
（A）免疫印迹分析AZD1775治疗与PLK1抑制剂BI-2536在指定时间点和浓度下对H322细胞PARP1和caspase 3裂解的影响。用100 nM葡萄孢菌素（STS）治疗作为阳性对照。（B） siRNA-介导的*WEE1号机组*和*PLK1*48小时后在H322细胞中（C）siRNA-介导的*WEE1号机组*和*PLK1*48小时和72小时后，在H322细胞数上。星号表示p值≤0.05（*）、0.01（**）和0.001（***），通过t检验确定。

**图4。WEE1和PLK1双重靶向作用对H322细胞凋亡和增殖的影响**
（A） siRNA介导的单和双敲低的指示蛋白的免疫印迹分析*WEE1号机组*和*PLK1*转染后72小时和1μM AZD1775（+）或DMSO（−）处理48小时后在H322细胞中培养。模拟：仅DMSO和脂质体。低曝光：低暴露；高博览会：高暴露。（B） siRNA介导的单链和双链敲除*WEE1号机组*和*PLK1*在转染后72小时和48小时DMSO（−）、0.3μM AZD1775或1μM AZD1775处理后，H322细胞数量增加。星号表示通过t检验确定的p值≤0.05（*）、0.01（**）和0.001（***）；注：不重要。

**图5。AZD1775和BI-2536对WEE1 CRISPR-Cas9基因敲除细胞活性的影响**
（A）基因敲除策略示意图*WEE1号机组*由CRISPR-Cas9针对*WEE1号机组*外显子1/内含子1剪接位点。Wt：野生型；gRNA：指导RNA。（B）对不同H322-based CRISPR-Cas9克隆的指示蛋白质进行免疫印迹分析，从而识别敲除克隆cWEE1号机组-KO和cWEE1号机组-KO和阴性对照克隆cWEE1号机组具有完整的WEE1表达。（C） C的指示蛋白的免疫印迹分析*WEE1号机组*-通过异位表达myc标记的WEE1（RC#）重建KO克隆。UT：未转染；瞬时：瞬时转染。（D）用AZD1775或BI-2536处理72小时后，抑制亲代H322细胞和指示的CRISPR-Cas9克隆活力的剂量-反应曲线，如CellTiterGlo分析测定的，以及相应的IC₅₀值。（E）抑制亲代H322细胞活性的剂量-反应曲线，周1淘汰克隆cWEE1号机组-KO和*WEE1号机组*根据CellTiterGlo分析测定，用AZD1775处理72小时后，用相应的IC重建克隆RC9₅₀值。

**图6。AZD1775对小鼠γH2AX水平的影响*WEE1号机组*CRISPR-Cas9敲除细胞**
亲代H322细胞中γH2AX和总H2AX的免疫印迹分析表明CRISPR-Cas9基因敲除（cWEE1号机组-KO，c公司*WEE1号机组*-KO）和阴性对照（cWEE1号机组)4h AZD1775（1μM）或顺铂（17μM）处理后克隆。箭头表示未泛素化（~16 kDa）和单泛素化γH2AX。

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1. Parker LL，Piwnica-Worms H.人类WEE1酪氨酸激酶对p34cdc2-cyclin B复合物的失活。科学。1992;257:1955–7.-公共医学
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