Characteristics of primary rat microglia isolated from mixed cultures using two different methods

doi:10.1186/s12974-017-0877-7

.2017年5月8日；14(1):101.

doi:10.1186/s12974-017-0877-7。

两种不同方法混合培养的大鼠原代小胶质细胞的特性

李林^1 2, 拉基·德赛², 王晓英², 发动机H低^三, 长虹星⁴

附属公司

¹温州医科大学药学学院，浙江温州，325035，中国。
²美国马萨诸塞州总医院放射科和神经科神经保护研究实验室，哈佛医学院，MGH East 149-2401，Charlestown，MA，02129。
^三马萨诸塞州总医院放射科和神经病学系神经保护研究实验室，哈佛医学院，MGH East 149-2401，Charlestown，MA，02129，美国。Lo@helix.mgh.harvard.edu。
⁴美国马萨诸塞州总医院放射科和神经科神经保护研究实验室，哈佛医学院，MGH East 149-2401，Charlestown，MA，02129。xing.changhong@mgh.harvard.edu。

PMID： 28482909
预防性维修识别码：项目经理5422983
内政部： 10.1186/s12974-017-0877-7

两种不同方法混合培养的大鼠原代小胶质细胞的特性

李林等。 J神经炎症. 2017.

.2017年5月8日；14(1):101.

doi:10.1186/s12974-017-0877-7。

作者

李林^1 2, 拉基·德赛², 王晓英², 发动机H低^三, 长虹星⁴

附属公司

¹温州医科大学药学院，浙江温州，325035。
²美国马萨诸塞州总医院放射科和神经科神经保护研究实验室，哈佛医学院，MGH East 149-2401，Charlestown，MA，02129。
^三美国马萨诸塞州总医院放射科和神经科神经保护研究实验室，哈佛医学院，MGH East 149-2401，Charlestown，MA，02129。Lo@helix.mgh.harvard.edu。
⁴美国马萨诸塞州总医院放射科和神经科神经保护研究实验室，哈佛医学院，MGH East 149-2401，Charlestown，MA，02129。xing.changhong@mgh.harvard.edu。

PMID： 28482909
预防性维修识别码：项目经理5422983
内政部： 10.1186/s12974-017-0877-7

摘要

背景：小胶质细胞培养是研究几乎所有中枢神经系统疾病炎症机制的一个至关重要的模型系统。轻度胰蛋白酶化和摇晃是从混合胶质培养物中分离原代小胶质细胞最常用的两种方法。在本研究中，我们对使用这两种方法获得的小胶质细胞进行了表征和比较。

方法：从1～2天龄新生Sprague-Dawley大鼠的大脑皮层制备原代大鼠小胶质细胞培养物。在体外约14天达到融合后，通过轻度胰蛋白酶化或摇晃从混合胶质培养物中分离出小胶质细胞。流式细胞术检测小胶质细胞纯度。定量实时PCR检测mRNA表达。使用ELISA试剂盒测量细胞培养上清液中的TNFα、IL-1β、IL-10和IGF-1。使用荧光标记的大肠杆菌K-12生物颗粒评估吞噬功能。

结果：温和的胰蛋白酶化比摇动产生更高的产率和纯度。轻度胰蛋白酶化分离的小胶质细胞呈静态分支形态。通过摇晃分离的小胶质细胞显示出更为异质的形态，包括圆形细胞，暗示着活化。与摇晃相比，胰蛋白酶分离的小胶质细胞基线表型标记物（iNOS、CD86、CD206和精氨酸酶1）较低，细胞因子（TNFα、IL-1β、IL-10和IGF-1）水平较低，吞噬能力降低。这两种方法都能产生对各种刺激如IL-4、脂多糖（LPS）或干扰素-γ（IFNγ）有反应的小胶质细胞。虽然基因表达和细胞因子释放的刺激模式大体相似，但在绝对反应方面也存在显著差异。与摇晃相比，LPS处理诱导轻度胰蛋白酶化分离的小胶质细胞中TNFα和IL-10水平显著升高。与摇晃相比，IFNγ在轻度胰蛋白酶化的小胶质细胞中诱导了较低的TNFα反应。

结论：我们的结果表明，用摇动法分离小胶质细胞，即使在基线时也可能会引起轻微的激活，这可能会影响后续实验中的刺激反应。在为原代小胶质细胞培养选择分离方案时，应谨慎和注意。

关键词：免疫反应；小胶质细胞；轻度胰蛋白酶化；表型；初级培养；颤抖。

PubMed免责声明

数字

图1
通过使用术语“小胶质细胞AND（大鼠或小鼠）AND primary AND culture NOT review[出版类型]”搜索PubMed，可用于初级啮齿动物小胶质细胞培养的各种方法的比例

图2
使用温和胰蛋白酶获得的原代培养小胶质细胞的形态、产量和纯度(E类)或摇晃(*S公司*).一,b条轻度胰蛋白酶化法分离的原发性小胶质细胞的形态学(一)或摇晃(b条).比例尺 = 50微米。**c（c）**,d日轻度胰蛋白酶法分离的原发性小胶质细胞的Iba-1免疫染色(**c（c）**)或摇晃(d日).比例尺 = 50微米。**e（电子）**小胶质细胞培养的产量。n个 = 5（f）–小时轻度胰蛋白酶化法分离的原发性小胶质细胞大小(**（f）**)或摇晃(克).n个 = 5我–n个轻度胰蛋白酶法分离的原代小胶质细胞的纯度(我,我)或摇晃(j个,米)用CD11b流式细胞术测定(我–k个)或CD45(我–n个)染色。n个 = 5*第页 < 0.05

图3
轻度胰蛋白酶化分离的原代培养小胶质细胞的基因表达、细胞因子释放和吞噬作用的基线水平(E类)或摇晃(*S公司*).一基因表达的基线水平。n个 = 3–6.b条小胶质细胞条件培养基中TNFα、IL-1β、IL-10和IGF-1的基线水平。n个 = 4c（c）–**e（电子）**流式细胞术显示轻度胰蛋白酶化分离的原代小胶质细胞CD68阳性细胞(**c（c）**)或摇晃(d日).n个 = 5（f）–小时轻度胰蛋白酶化法分离的原发性小胶质细胞吞噬作用(**（f）**)或摇晃(克).n个 = 4. *第页 < 0.05

图4
轻度胰蛋白酶化原代培养小胶质细胞基因表达的变化(E类)或抖动(*S公司*)用20 ng/ml的IL-4治疗后(一)，50 ng/ml LPS(b条)，或20 ng/ml干扰素γ(**c（c）**)持续8小时。n个 = 3–6

图5
形态变化(一–小时)和细胞因子释放(我–我)轻度胰蛋白酶化法分离的原代培养小胶质细胞(E类)或摇晃(*S公司*)用20 ng/ml IL-4、50 ng/ml LPS或20 ng/ml IFNγ治疗24小时后。n个 = 4比例尺 = 50微米。米–o个轻度胰蛋白酶化法分离的原代培养小胶质细胞释放细胞因子数据的再分析(E类)或摇晃(*S公司*)用20 ng/ml的IL-4治疗后(米)，50 ng/ml LPS(n个)，或20 ng/ml干扰素γ(o个)持续24小时。数据显示为与对照组相比的折叠变化*第页 < 0.05; **第页 < 0.01

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[6] Polazzi E，Monti B.小胶质细胞和神经保护：从体外研究到治疗应用。神经生物学进展。2010;92(3):293–315. doi:10.1016/j.pneurobio.2010.06.009。-内政部-公共医学

[7] Benoit M、Desnues B、Mege JL。细菌感染中的巨噬细胞极化。免疫学杂志。2008年；181(6):3733–9. doi:10.4049/jimmunol.181.6.3733。-内政部-公共医学

[8] Benoit M、Desnues B、Mege JL。细菌感染中的巨噬细胞极化。免疫学杂志。2008年；181(6):3733–9. doi:10.4049/jimmunol.181.6.3733。-内政部-公共医学

[9] Geissmann F、Auffray C、Palframan R、Wirrig C、Ciocca A、Campisi L等。血液单核细胞：不同亚群，它们与树突状细胞的关系，以及它们在调节T细胞反应中的可能作用。免疫细胞生物学。2008年；86(5):398–408. doi:10.1038/icb.2008.19。-内政部-公共医学

[10] Geissmann F、Auffray C、Palframan R、Wirrig C、Ciocca A、Campisi L等。血液单核细胞：不同亚群，它们与树突状细胞的关系，以及它们在调节T细胞反应中的可能作用。免疫细胞生物学。2008年；86(5):398–408. doi:10.1038/icb.2008.19。-内政部-公共医学

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