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.2017年5月2日；114（18）：E3709-E3718。
doi:10.1073/pnas.1619406114。 Epub 2017年4月18日。

健康成人肠道神经系统通过神经元凋亡和神经发生之间的动态平衡来维持

Subhash Kulkarni公司 1, 玛丽亚·德莱德·米奇 2, 詹娜·莱斯尔 1, 申昌植 三, 石城汤 4, 亚元福 1, 刘连胜 1, 钱丽 1, 莫纳利·萨哈 1, 李翠萍 1, 格里戈里·埃尼科洛波夫 5 6, 拉伦·贝克尔 7, 尼古拉·拉赫林 8 9, 米歇尔·安德尔森 10 11 12 13, 西岭沈 8 9, 新中洞 10 11 12 13, 曼尼什·J·巴特 14, 宋红军 10 15, E Michelle Southard-Smith女士 16, 拉杰·卡普尔 17, 米莱娜·博古诺维奇 三, 潘卡杰·J·帕斯里察 18
附属机构

健康成人肠道神经系统通过神经元凋亡和神经发生之间的动态平衡来维持

Subhash Kulkarni公司等人。 美国国家科学院程序. .

摘要

根据目前的教条，在发育完全的成人肠道神经系统中很少或根本没有正在进行的神经发生。鉴于之前关于神经元持续死亡的报道，这种缺乏神经发生的现象使得成人肠道中肠道神经元群是如何维持的这个问题没有答案。在此，我们确认，尽管由于成人小肠肌间神经节细胞凋亡而导致神经元细胞持续丢失，但肌间神经元总数保持不变。这种观察到的神经元稳态是由体内分裂前体细胞形成的新神经元维持的，这些前体细胞位于肌间神经节内，表达Nestin和p75NTR，但不表达泛神经胶质标记物Sox10。成人前体细胞池中磷酸酶和张力蛋白同源基因的突变导致肠神经元数量增加，导致神经节神经瘤病，模拟了人类的相应疾病。综上所述，我们的研究结果显示成人肠道神经元的显著更新和神经发生，为理解健康和疾病中的肠道神经系统提供了范例。

关键词：雀巢；成人神经发生；肠神经前体细胞；肠神经元；神经元凋亡。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
成人肌间神经细胞经历凋亡介导的细胞死亡。(A类,我)肌间神经节内表达凋亡标记的细胞裂解caspase-3（红色）(ii（ii）)也表达HuC/D（绿色）代表凋亡神经元（黄色箭头），而其他肌间神经细胞不表达裂解caspase-3（蓝色箭头）。细胞核用DAPI（蓝色）标记。(B类)ChAT-cre：YFP成年小鼠肌间神经节内用PI（红色）标记的活体细胞核，胆碱能神经元用YFP（黄色）标记，代表细胞膜漏出的神经元，指示凋亡细胞（深蓝色箭头）。(C类)成年C57BL/6小鼠的肌间神经节图像，凋亡细胞被标记为(我)CellEvent caspase-3/7检测染料（红色），然后用(ii（ii）)HuC/D（绿色）显示阳性（红色箭头）和凋亡标记阴性（绿色箭头）的肌间神经细胞群。(三)DAPI标记的细胞核（浅灰色）。（比例尺，10µm）
图S1。
图S1。
成年肌间神经细胞群经历神经元丢失，并被肌层巨噬细胞主动吞噬。(A类)的正交截面z（z）-ChAT-cre：YFP成年小鼠的肌间神经节堆叠图像，其中YFP（黄色）由肌间胆碱能神经元表达，因此，标记了在杀死前在体内给予PI的肌间神经节，并显示了YFP的存在+带PI染色细胞核的成年肌间神经元（黄色）（红色；XY平面上的白色箭头和YZ平面上的红色箭头）。(B类)ChAT-cre的肌间神经丛层图像：YFP动物（体内用PI标记，如上所示）在组织固定后（这导致YFP信号丢失，PI染色强度预期显著降低）（31），并用泛神经标记物HuC/D抗血清染色，显示(我,ii（ii）)两个HuC/D标记的神经元（绿色），其中一个神经元的细胞核标记有PI（红色；白色箭头），另一个则没有PI（绿色箭头）。(三)细胞核后染色也用DAPI（蓝色）进行复染。(iv（四）)合并图像，显示标记为PI（白色箭头）的单元格和未标记PI的单元格中HuC/D（绿色）和DAPI（蓝色）的共定位（绿色箭头）。（比例尺，10µm）(C类,我)ChAT-cre：td番茄小鼠结肠肌间神经丛的双光子显微镜显示，td番茄表达（红色）胆碱能神经元以及MHC-II标记的肌层巨噬细胞（绿色）显示，大量巨噬细胞与肌间神经网相关。（比例尺，50μm）插入来自(我)被放大并显示(ii（ii）)在MHC-II标记的巨噬细胞（绿色；青色箭头）中吞噬td番茄表达的神经元胞体（红色）。(三和iv（四）)MHC-II染色（绿色）和ChAT-cre:td番茄荧光分别位于不同面板中。(D类,我)小肠肌间神经节内神经元共焦显微镜图像z叠加的2D投影图像显示ChAT-cre：tdTomato（红色）信号与CD11b染色的（绿色）肌层巨噬细胞信号的共定位。插入(我)在进一步的面板和显示中被放大(ii（ii）)CD11b染色的巨噬细胞吞噬td番茄表达的神经元胞体（红色）（绿色；青色箭头），表明巨噬细胞吞噬了肌间神经细胞。(三和iv（四）)CD11b染色（绿色）和ChAT:tdTomato（红色）荧光分别显示在单独的面板中。（比例尺，10μm）(E类)DAPI流式细胞术−CD45型−WT（对照）和ChAT-cre:tdTomato小鼠LM-MP层的细胞显示在ChAT-cre：tdTomato-小鼠的非造血细胞中存在强烈的神经相关tdTomata信号(左侧)，被大量DAPI占用−CD45型+CD11c公司+CD11b细胞+MHCII公司你好与肌间神经丛相关的肌层巨噬细胞(居中)，但不与DAPI一起使用−CD45型+CD11c公司你好CD11b细胞+MHCII公司你好与大量肠道神经元无关的粘膜和粘膜下巨噬细胞(对). (F类)与WT对照组相比，含有td番茄红素内含物的小肠（SB）和大肠（LB）巨噬细胞百分比的平均值±SE，表明神经碎片在肠道长度上的强烈吞噬作用相似。
图2。
图2。
细胞凋亡导致的肌间神经细胞丢失可以量化，并且可以使用抗凋亡药物来阻止。(A类和B类)成人NOS1-creER的肌间神经节图像T2段：td停止三苯氧胺诱导后第二天处死的番茄小鼠（第0天），并用NOS1抗血清染色（绿色）(A类)另一例在他莫昔芬诱导停止7天后死亡(B类). 第0天(A类)，所有表达NOS1的神经元都表达tdTomato（黄色箭头），而在第7天(B类)，一群不表达tdTomato的NOS1表达神经元出现（蓝色箭头）。Nuclei标记在B类带DAPI（蓝色）。（比例尺，10µm）(C类)活体动物双光子显微镜捕获的3D图像的二维投影[(我)时间0和(ii（ii）)时间24h]从NOS1-creER肌间神经丛的同一区域T2段：td成像前用三苯氧胺诱导的番茄小鼠显示td番茄消失+24小时内的氮能神经元（绿色箭头）。图像还显示（白色箭头）tdTomato新投影的出现+神经元在24h内迅速延伸形成新的网络连接，显示了肌间神经节神经元网络的强大可塑性。（比例尺，10µm）(D类和E类)用抗HuC/D抗血清（绿色）和抗裂解caspase-3抗体（红色）染色的肌间神经节代表性图像显示，在给予泛酶抑制剂zVAD-FMK的小鼠中，裂解caspase-3免疫反应缺乏(E类)，而未服用该药物的小鼠显示存在裂解的caspase-3标记的肌间神经细胞（黄色箭头E类). （比例尺，10µm）(F类)td番茄数量的量化+在第7天被杀死的三组不同小鼠的肌间神经节内表达HuC/D的神经元显示出显著的减少(*P（P）<0.05）在td番茄数量上+与第0天或给予zVAD-FMK的小鼠相比，不含zVAD-FMK的鼠每节神经元数。数据还显示，HuC/D的总数+肌间神经节内的神经元在第0天至第7天之间保持保守（没有zVAD-FMK），尽管tdTomato的数量+神经元萎缩。此外，zVAD-FMK给药引起的细胞凋亡减弱导致每个神经节肌间神经细胞总数显著增加(#P（P）<0.05）。
图3。
图3。
肌肉巨噬细胞吞噬健康肠道中的肌间神经细胞。(A类,我)ChAT-cre：td番茄小鼠结肠肌间神经丛的双光子显微镜显示，td番茄表达（红色）胆碱能神经元以及MHCⅡ类标记的肌层巨噬细胞（绿色）显示，大量巨噬细胞与肌间神经网相关。插入(我)被放大并显示(ii（ii）)在MHC II标记的巨噬细胞（绿色；青色箭头）中吞噬td番茄表达的神经元胞体（红色）。（比例尺，50µm）(B类,我)的二维投影图像z（z）-小肠肌间神经节内神经元的共焦显微镜图像堆栈显示ChAT-cre：tdTomato（红色）信号与CD11b染色的（绿色）肌层巨噬细胞信号共定位。插入(我)放大并显示(ii（ii）)CD11b染色的巨噬细胞吞噬td番茄表达的神经元胞体（红色）（绿色；青色箭头），表明巨噬细胞吞噬了肌间神经细胞。（比例尺，10µm）
图4。
图4。
Nestin标记成人肠壁中可能存在的肠神经前体细胞。(A类)体外培养的Nestin-creER神经球衍生神经元T2段：td番茄鼠标(我)被NOS1（绿色）和(ii（ii）)在Nestin-creER下快递tdTomato（红色）T2段诱导(三)显示共定位，证明表达Nestin的细胞在培养基中生成神经球，可分化为氮能神经元；(iv（四）)细胞核用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，10µm）(B类)Nestin-creER所在成年小鼠的肌间神经节T2段：td将番茄衍生的神经球衍生细胞移植到(我)td番茄+移植物衍生细胞（红色；白色箭头）(ii（ii）)形成表达HuC/D（洋红色；白色箭头）的成熟神经元，表明移植物衍生细胞产生神经元。可以注意到其他tdTomato表达式（红色箭头），它没有显示相应的HuC/D同位化。HuC/D和tdTomato通道在图S3中分离A类.细胞核用DAPI（蓝色）复染。（比例尺，10µm）
图S2。
图S2。
(A类)Nestin-creER肌间神经节的图像T2段：td给予克隆剂量他莫昔芬并在他莫昔酚诱导后12小时死亡的番茄小鼠显示(我)一个td番茄+肌间神经节中的细胞（红色、黄色箭头）(ii（ii）)通过免疫染色（灰色、黄色箭头）也可将巢蛋白染色为阳性，从而验证三苯氧胺诱导后td番茄表达细胞为巢蛋白表达细胞。户口C/D+（绿色）神经元不表达tdTomato（红色）。细胞核用DAPI染色呈阳性（蓝色）。（比例尺，10µm）(B类)用巢蛋白抗体标记并与Alexa 647抗体共染的Nestin-GFP转基因报告小鼠LM-MP层中巢蛋白-GFP表达和非表达细胞的FACS分析表明，巢蛋白免疫反应仅在Nestin-GFP中发现+细胞，而不在Nestin-GFP中−从而验证在成年LM-MP层中，Nestin-GFP+细胞是表达Nestin的细胞。
图S3。
图S3。
(A类,我)HuC/D免疫染色（品红色，黄色箭头）(ii（ii）)tdTomto公司+移植Nestin-cre:td番茄的WT动物的细胞（红色、黄色箭头）+单元格(三)细胞核标记有DAPI（蓝色），表明一些巢蛋白衍生细胞在移植后分化为神经元，而其他td番茄+细胞（红色箭头）不表达HuC/D，因此不能分化为神经元。（比例尺，10µm）(B类)优化组织变性，以使用来自WT小鼠回肠的LM-MP组织对卤代核苷酸（CldU和IdU）进行有效的免疫染色，所述WT小鼠回肠被给予CldU 7天并立即杀死。图像(i–iii)在用2 N HCl在50°C下变性5、10和15分钟的组织上分别显示CldU和HuC/D免疫染色。虽然5分钟变性后未显示任何标记阳性细胞，但很少有标记阳性神经节外细胞（红色箭头），但10分钟变性后无神经元标记。然而，变性15分钟后，可以标记神经节外（红色箭头）和神经节内的标记细胞，其中一些是HuC/D表达神经元（黄色箭头）。（比例尺，10μm）(C类)与我们上面的观察结果相比，未暴露于CldU的动物的组织在50°C下用2N HCl进行类似变性后，使用对CldU有反应的抗体，没有显示出假阳性免疫染色细胞的存在(我) 5, (ii（ii）)10，和(三)15分钟（比例尺，10μm）(D类,我,ii（ii）,三)用HuC/D（灰色）染色的肌间神经节被定义为一组凝聚力不间断的神经元，其界限如这三张显微照片所示。这些神经节的神经元被计数并用于量化。神经节外的一到两个神经元未被计数，因为它们被视为神经节外神经元。
图5。
图5。
肠壁中增殖性神经嵴衍生的假定肠神经前体细胞的分布。(A类)Nestin-GFP报告小鼠肠道壁的3D投影图像，血管用DiD（青色）灌注，细胞核用PI（浅灰色）复染，显示表达Nestin-GFP（绿色）的细胞形成广泛的网络，存在于肠道的许多层，从纵向和平滑肌层（分别标记为LM和SM）到粘膜（标记为M）。(B类)Nestin-GFP细胞网络在成人回肠肠壁内的三维投影，无血管和核染色（纵向和平滑肌层分别标记为LM和SM，粘膜标记为M）。白色箭头A类和B类两者都指向肌间神经节的位置。图像A类和B类使用10倍物镜拍摄。(C类)含有Nestin-GFP转基因的Wnt1-cre:td番茄小鼠的肌间神经丛图像显示，只有肌间神经节中表达Nestin-GFP的细胞（红色箭头），而不是血管周围细胞（绿色箭头）具有神经嵴起源。(D类)神经节内巢蛋白-GFP+在血管系统被DiD（红色）标记的小鼠中，细胞（绿色、绿色箭头）不表达泛神经标记物PGP9.5（洋红色、黄色箭头），这表明神经节内Nestin-GFP的表达没有标记神经元。(E类)只有Nestin-GFP的一个亚群+肌间神经节内而非血管外周的细胞（绿色细胞）表达低亲和力神经生长因子受体p75NTR（品红色），此处用黄色箭头标记一些双阳性细胞。肌间神经节内一些表达p75NTR的细胞不表达Nestin-GFP（*），而其他一些细胞既不表达Nessin-GFP也不表达p75NT（#）。(F类)类似地，神经节内Nestin-GFP群体+细胞（绿色细胞）表达CD49b（品红色），此处用黄色箭头标记一些双阳性细胞。(克,我)Nestin-GFP转基因报告小鼠回肠的肌间神经节中，Nestin-表达细胞表达GFP（绿色），显示Ki67+也表达Nestin-GFP的细胞（红色；黄色箭头）；(ii（ii）)细胞核的DAPI（蓝色）标记显示Ki67+Nestin-GFP细胞（黄色箭头）显示出与其他细胞不同的染色特征。（比例尺英寸C–G类，10微米）
图S4。
图S4。
神经节内表达Nestin的细胞是神经嵴衍生的细胞，可同时表达p75NTR和CD49b，并与一些表达胶质标记的细胞一起增殖生成神经元。的代表性图像(A类)Nestin-GFP X Wnt1 cre:td番茄小鼠的肌间神经节显示(我)Nestin-GFP–（绿色）表达和(ii（ii）)Wnt1-cre:td番茄–（红色）表达细胞，其中神经节内Nestin-GFP+单元格（黄色箭头）也是tdTomato+表明它们来源于神经嵴，而血管周巢蛋白GFP+（蓝色箭头）单元格不是。（比例尺，50µm）(B类)一只成年Nestin-GFP转基因报告鼠的肌间神经丛层投影图像，其血管系统已被DiD（青色）标记，其中(我)只有血管系统中作为周细胞出现的巢蛋白表达细胞（红色箭头），而不是神经节内表达巢蛋白的细胞（绿色箭头）(ii（ii）)当用周细胞标记物NG2特异性抗血清染色时，标记为（红色）。（比例尺，10µm）(C类)用CD49b抗体免疫染色的Nestin-GFP小鼠的肌间神经节，其中(我)神经节内（红色箭头）而非血管周围（绿色箭头）Nestin-GFP的人群+（绿色）单元格(ii（ii）)表达CD49b（洋红色）(三)细胞核用DAPI染色（浅灰色）。(iv（四）)合并图像显示GFP、CD49b和DAPI在神经节内细胞中的共定位（红色箭头）。（比例尺，25µm）(D类)用p75NTR特异性抗体免疫染色的成年Nestin-GFP小鼠的肌间神经节，其中(我)神经节内p75NTR亚群+（洋红色）单元格（黄色箭头）(ii（ii）)雀巢GFP+（绿色），而另一组神经节内p75NTR+单元格（*）不是Nestin-GFP+（比例尺，10µm）Nestin-creER的两个肌间神经节的图像T2段-td番茄小鼠给予克隆剂量的三苯氧胺，并在诱导后6天死亡，表明巢蛋白衍生的td番茄+单元格（红色）(E类)may（黄色箭头）或(F类)可能不会（红色箭头）产生S100β表达细胞（绿色）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。（比例尺，10µm）(克)Nestin的人口+单元格（绿色、黄色箭头）(我)Nestin-GFP成年小鼠的肌间神经节内(ii（ii）)将有丝分裂标记Ki67（红色）表达到(三)显示GFP和Ki67表达的共定位，并具有(iv（四）)DAPI（蓝色）核染色更强，表明DNA复制和DNA含量增加。（比例尺，10µm）(小时)Nestin creER的肌间神经节图像T2段：td番茄小鼠在三苯氧胺诱导6天后显示(我)tdTomato（红色）在神经节内细胞中的表达（白色和黄色箭头表示其中两个细胞），其中(ii（ii）)tdTomato在一个标记有泛神经标记物HuC/D（绿色，黄色箭头）抗血清的细胞中表达，而另一个表达tdTomato-的细胞没有标记HuC/D的细胞（白色箭头）。(三)细胞核用DAPI（蓝色）和(iv（四）)合并后的图像显示了表达tdTomato（红色）并用DAPI（蓝色）标记的HuC/D表达（绿色）细胞（黄色箭头），而另一个tdTomato-表达细胞（白色箭头）标记的是DAPI，但没有标记HuC/D。（比例尺，10µm）(我和J型)面板显示了一只成年C57BL/6小鼠回肠14-µm厚的横截面，该小鼠用IdU给药7天，不久后被杀死，用100 mM柠檬酸缓冲液变性，显示出(我)PGP9.5免疫反应神经元（绿色，箭头）(ii（ii）)也标记有识别IdU的抗体（红色，箭头）(三)其中用DAPI（蓝色，箭头）对细胞核进行反染色(iv（四）; 合并图像）出现由IdU脉冲期间循环的前体细胞产生的新生神经元。（比例尺，10µm）(K（K）)Nestin75NTR双阳性ENPC克隆繁殖获得的体外分化神经球单色图像(我)GFAP的免疫染色(ii（ii）)Nestin-GFP的表达。(三)PGP9.5（黄色箭头）和(iv（四）)DAPI核标记显示克隆衍生的神经圈分化为不与Nestin-GFP共存的神经元。GFAP的表达模式与Nestin-GFP相似，但并不完全相同。（比例尺，10µm）
图S5。
图S5。
两个Nestin-creER肌间神经节的图像T2段-在两个不同时间点给予克隆剂量他莫昔芬的td番茄小鼠显示(A类)24小时大多数肌间神经节含有一个td番茄+（红色）单元格，但位于(B类)三苯氧胺诱导后6天，大多数肌间神经节含有>1 td番茄+表明体内巢蛋白衍生细胞增殖的细胞。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（比例尺，10µm）(C类)成人小肠肌间神经节抗体染色(我)S100β（蓝色）(ii（ii）)PGP9.5（红色），含(三)Nestin-GFP报告转基因（绿色）显示(iv（四）; 融合图像），而巢蛋白和PGP9.5表达细胞形成两个不同的亚群，肌间巢蛋白GFP表达细胞共表达S100β。（比例尺，100μm）
图6。
图6。
体外增殖和神经源性分化的能力仅限于共表达Nestin-GFP和p75NTR的肌间细胞。(A类)p75NTR免疫染色标记大多数细胞呈不同强度的阳性（蓝色曲线），与此处显示的未染色细胞相比呈红色阴影曲线，但只有高度标记的细胞（10.2%的细胞）被视为阳性。这些数据用于设置p75NTR的流量分拣门+人口。(B类)细胞根据四个象限中设置的门进行巢蛋白-GFP和p75NTR染色。(C类)在Nestin-GFP报告小鼠LM-MP层的完全确定的流式分选单细胞培养基中进行的体外克隆分析表明，只有表达Nestin-GFP的细胞具有增殖潜能。(D类)在完全确定的培养基中进行的体外克隆分析显示，单独的Nestin-GFP和p75NTR共表达细胞具有增殖潜力。(E类)克隆衍生的神经球在含有神经基底培养基、B27、BSA和β-巯基乙醇但不含生长因子的规定培养基中分化，以生成分化细胞，其中一些细胞显示(我)Nestin-GFP（绿色）的持续表达，而其他表达导致(ii（ii）)未显示Nestin-GFP共表达的PGP9.5表达神经元（红色，红色箭头），或(三)表达GFAP的细胞（蓝色），其可能显示Nestin-GFP的共定位（绿色箭头）。Nuclei标有DAPI(iv（四）)，此处显示为浅灰色。（比例尺，10µm）
图7。
图7。
成年肌间神经节内增殖表达Nestin的细胞的体内神经发生。在Nestin-creER中T2段：td克隆剂量的他莫昔芬诱导的番茄小鼠，我们观察到(A类)三苯氧胺诱导后12小时，td番茄+肌间神经节中的细胞（红色；红色箭头）与泛神经标记物HuC/D（绿色；绿色箭头）不重叠，而(B类)诱导6天后，我们观察到HuC/d的种群+肌间神经节中的（绿色）细胞出现，表达tdTomato（红色）和荧光黄（此处用白色箭头标记）。同一神经节还包含HuC/D标记的（绿色）神经元，这些神经元不是从tdTomato表达细胞衍生而来的（绿色箭头）。td番茄+不表达HuC/D的细胞也存在于肌间神经节（红色箭头）。使用DAPI（蓝色）对两幅图像中的细胞核进行反染色。（比例尺，10μm）此外(C类)与三苯氧胺诱导后12小时和24小时相比，我们观察到表达HuC/D的td番茄数量增加+第6天和第14天的神经元(*P（P）<0.05），表明神经元继续从表达Nestin的细胞衍生而来。(D类)td番茄+克隆剂量标记后6天，肌间神经节内的细胞数量显著增加，这表明它们在体内增殖(**P（P）< 0.001).
图8。
图8。
标签染色实验表明，通过增殖表达Nestin的前体细胞，可以快速有力地生成肌间神经。(A类,我)对成年C57BL/6 WT小鼠回肠横截面（14µm厚）进行100mM柠檬酸盐缓冲液变性后，IdU染色显示肠隐窝中预期的阳性染色（绿色箭头）以及LM-MP层中的染色（红色箭头，在随后的面板中放大的虚线矩形）。(ii（ii）)PGP9.5免疫反应神经元（绿色、红色箭头），其中细胞核用DAPI（蓝色）复染(三)还标记有针对IdU的特异性抗体（红色），表明存在来自IdU脉冲期间循环的前体细胞的新生神经元。（比例尺，10μm）(B类,我)CldU标签（绿色）和(ii（ii）)IdU标记的（红色）细胞表达(三)HuC/D（蓝色）和(iv（四）)tdTomato（青色）是由tdTomata衍生而来的神经元（黄色箭头）+在IdU和CldU脉冲期间，表达巢蛋白的细胞至少循环两次以产生神经元。由于三苯氧胺以克隆剂量给药，只有前体细胞及其衍生神经元的亚群表达tdTomato。相同的图和面板显示了来自前体细胞的神经元（红色箭头），该前体细胞仅在IdU脉冲期间循环，其中可以检测到IdU（红色）的存在，但不能检测到CldU（绿色）。（比例尺，10µm）(C类)出生时带有单个标记的神经元的百分比（IdU+或CldU+)因此，与生下来就具有两种标记的神经元相比，源于在两种条件下都只循环一次的前体细胞，因此源于在这两种条件中循环生成神经元的前体电池。这一发现表明前体细胞的循环速率很高。我们还看到一小部分神经元是从实验期间没有循环的前体细胞中出生的，因此它们要么是在实验期间出生的，要么是在试验前循环的细胞，要么是实验前出生的细胞。(D类)在健康成年小鼠中，我们观察到，在取样的21天内，同窝成年鼠肌间神经节中的平均神经元数量高度保守。
图9。
图9。
敲除成年ENPC中的PTEN可显著增加神经元数量和大小，并显著增加整体转运时间。(A类和B类)用三苯氧胺诱导30天后，显微照片显示Nestin-PTEN WT和Nestin-PTEN cKO小鼠肌间神经节中HuC/D染色（绿色）神经元。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（比例尺，10μm）我们观察到(C类)HuC/D显著增加+Nestin-PTEN cKO小鼠肌间神经丛中的神经元与其WT对照Nestin-PTEN WT小鼠相比(D类)Nestin-PTEN cKO小鼠的神经元平均大小（用Feret直径表示：神经元细胞体的直径）显著高于其WT对照组(P（P）< 0.05). (E类)与年龄匹配的Nestin-PTEN WT小鼠相比，使用三苯氧胺诱导30天后的Nestin PTEN cKO小鼠显示胭脂红染料的全程转运时间显著增加，而这些小鼠同样使用三苯二甲胺诱导(P（P）= 0.04).
图S6。
图S6。
成年肌间神经节内的巢蛋白表达细胞不表达泛更年期胶质标记物Sox10，但表达与胶质细胞相关的其他基因。(A类)雀巢（红色）未标记Sox10+细胞（绿色）和因此表达巢蛋白的细胞（红色箭头）在与DAPI（蓝色）共染色的Sox10-H2BEnus小鼠的肌间神经节中形成与表达Sox10的细胞（黄色箭头）不同的成年肌间细胞群。不表达Nestin或Sox10的细胞也出现在肌间神经节中。（比例尺，10µm）对Nestin-GFP转基因报告鼠LM-MP衍生细胞中GFAP和S100表达细胞的FACS分析显示(B类)同时表达GFAP和S100（GFAP）的细胞群+第100页+)，以及未标记细胞群（阴性）、GFAP单表达细胞（GFAP+)和S100单表达细胞（S100+). (C类)GFAP和S100共表达细胞根据其荧光强度的任意细分（通过GFAP和S100的增加共表达标记为群体1到5），揭示出(D类)GFAP和S100的较高荧光强度（从而表达）与神经嵴干细胞标记物p75NTR和(E类)增加Nestin-GFP细胞的存在。仅表达GFAP的细胞(F类)Nestin-GFP和(克)也不表达高水平的p75NTR。S100单表达细胞(F类)确实表达Nestin-GFP，但是(克)不要表达高水平的p75NTR。红色阴影人口D–G型表示阴性人群。
图S7。
图S7。
小鼠早期发育和成年前体细胞神经胶质生成潜能差异的示意图。肠迷走神经嵴干细胞（EV-NCSC）为Sox10+细胞，来源于胚胎神经嵴（Wnt1+Sox10型+)迁移到发育肠道并生成Sox10−神经元和Sox10+ENS发育过程中的胶质细胞。这些Sox10+EV-NCSC还导致成人ENPC不表达Sox10型但一定要快递内斯汀成人ENPC不仅用成人（Sox10）替换早期发育期间出生的神经元−)神经元，也可以通过产生稳态神经元来维持成年神经元的种群，以取代因凋亡而丢失的成年神经元。Sox10+胶质细胞和胶质前体细胞也存在于成人肠道中，在那里产生Sox10+成熟的成年胶质细胞，在某些损伤状态下，可能生成成年神经元。
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