New method for quantification of gasotransmitter hydrogen sulfide in biological matrices by LC-MS/MS

doi:10.1038/srep46278

.2017年4月13日：7:46278。

doi:10.1038/srep46278。

LC-MS/MS定量生物基质中气体传递物硫化氢的新方法

Bo Tan（伯坦）^1 2 三, 盛进（Sheng Jin）^4 5, 孙继平⁵, 顾仲恺^6 7, 孙晓天⁸, 朱宜春⁵, 可可活⁷, 曹宗联⁹, 平阳⁹, Xin小明^三, 刘新华^三, 潘丽龙^三, 芙蓉秋¹, 建江¹, 贾一群¹⁰, 叶福源¹⁰, 谢颖（音）^1 2, 朱一准^2 三

附属公司

¹中国上海中医药大学附属曙光医院临床药理学系。
²澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室及药学院，澳门。
^三复旦大学药学院药理学系生物活性小分子上海重点实验室，上海，中国。
⁴河北医科大学生理学系，河北，中国。
⁵复旦大学上海医学院生理与病理生理学系，中国上海。
⁶复旦大学生物科学研究所，上海，中国。
⁷复旦大学生命科学学院基因工程国家重点实验室，中国上海。
⁸复旦大学华山医院心胸外科，上海，中国。
⁹复旦大学药学院分析中心，上海，中国。
¹⁰上海中医药大学仪器分析中心，中国上海。

PMID： 28406238
预防性维修识别码： PMC5390247万元
内政部： 10.1038/srep46278

LC-MS/MS法测定生物基质中气体变送器硫化氢含量的新方法

谭波等。科学代表. 2017.

.2017年4月13日：7:46278。

doi:10.1038/srep46278。

作者

Bo Tan（伯坦）^1 2 三, 盛进（Sheng Jin）^4 5, 孙继平⁵, 顾仲恺^6 7, 孙晓天⁸, 朱宜春⁵, 可可火⁷, 曹宗联⁹, 平阳⁹, Xin小明^三, 刘新华^三, 潘丽龙^三, 邱芙蓉¹, 建江¹, 贾一群¹⁰, 叶福源¹⁰, 谢莹^1 2, 朱一准^2 三

附属公司

¹中国上海中医药大学附属曙光医院临床药理学系。
²澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室及药学院，澳门。
^三复旦大学药学院药理学系生物活性小分子上海重点实验室，上海，中国。
⁴河北医科大学生理学系，河北，中国。
⁵复旦大学上海医学院生理与病理生理学系，中国上海。
⁶复旦大学生物科学研究所，上海，中国。
⁷复旦大学生命科学学院基因工程国家重点实验室，上海，中国。
⁸复旦大学华山医院心胸外科，上海，中国。
⁹复旦大学药学院分析中心，上海，中国。
¹⁰上海中医药大学仪器分析中心，上海，中国。

PMID： 28406238
预防性维修识别码： PMC5390247万元
内政部： 10.1038/srep46278

摘要

硫化氢广泛存在于哺乳动物组织中，在生理和病理生理过程中发挥着重要作用。然而，在文献中不同测量值之间，生物基质中检测到的硫化氢浓度存在显著的数量级差异，这导致检测硫化氢生物相关性的不确定性。在这里，我们开发并验证了一种液相色谱-质谱（LC-MS/MS）方法，该方法通过测定硫化氢和一溴双环芳烃的衍生物硫化物二亚胺（SDB）来测定各种生物基质中的硫化氢。³⁶合成并验证S-标记SDB作为内标物。该方法已成功用于测量各种生物基质中的硫化氢水平，如不同物种的血液、血浆、组织、细胞和酶。此外，利用该方法揭示了硫化氢与人血清蛋白（HSA）和血红蛋白（HB）松散非共价结合的新模式。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

**图1。不同生物基质中硫化氢的分析。**
(一,b)硫化氢衍生物硫化二亚胺（SDB）的MS/MS光谱(一)和³⁶硫标记硫化物二比曼(³⁶S-SDB）(b). (**c（c）**,d日)选定的反应监测（SRM）色谱图(*米/z*415.3至*米/z*223.3) (**c（c）**)或(*米/z*419.3至*米/z*227.3) (d日)用于硫化钠溶液（5μM）。(**e（电子）**,如果)SRM色谱图(*米/z*415.3至*米/z*223.3) (**e（电子）**)或(*米/z*419.3至*米/z*227.3) (如果)对于³⁶S标记硫化钠溶液（5μM）。(克)SDB（1.25μM）和³⁶S标记的SDB（0.313μM），置于正宗标准溶液中。(小时)SDB和³⁶小鼠空白血浆中S-标记SDB（IS）。使用UPLC（Waters）和三重四极杆质谱仪（AB Sciex 5500）收集数据。

**图2。MBB衍生化条件的优化。**
(一,b)在硫化钠溶液（1μM）中测试三个pH值和培养时间(一)和小鼠血浆(b). (**c（c）**)衍生化120分钟后，通过硫化钠溶液（1μM）或小鼠血浆在pH 7.5下的反应，在三个pH值下的正常反应。(d日)小鼠血浆中Tris-HCl（pH 8.5）缓冲液在三种离子强度（100、200、600 mM）下的反应比较。(**e（电子）**)四种硫化钠水平（0.313、1.25、5和20μM）在添加或不添加2.0 mg/mL EDTA的情况下的响应线性比较。数据表示为平均值±SD（n=3）。

**图3。验证分析的稳健性、信噪比和线性。**
(一)24小时内未使用内标物（IS）处理过的小鼠血浆中硫化氢反应的差异(b)30天以上IS处理小鼠血浆中硫化氢反应的差异。(**c（c）**)带有IS的硫化氢标准曲线(年 = 2.57x个 + 0.025,第页 = 0.9981）。(d日)硫化氢外标曲线与³⁶S标记的硫化氢。(**e（电子）**)量化下限（0.039μM）下硫化氢的信噪比值。(如果)处理过的小鼠血浆中硫化氢在室内光照下24小时的稳定性（数据通过IS响应重建）。每个点代表三倍的平均值。虚线表示±15%的变化。

**图4。大鼠心室肌细胞（NRCMs）和酵母CSE酶（CYS3）中硫化氢的测定。**
(一)使用两种底物生产硫化氢，L-半胱氨酸用于CSE，D-半胱氨酸则用于NRCM中的3MST。(b)NRCM中含有或不含有CSE siRNA的硫化氢生成。(**c（c）**)NRCM中经过或未经高糖处理的硫化氢水平。(d日)酵母CYS3中L-胱硫醚（CTT）产生硫化氢。(**e（电子）**,如果)在酵母CYS3中利用S-丙炔半胱氨酸（SPRC）生产硫化氢(**e（电子）**)或使用(如果)丙炔甘氨酸（PAG）抑制剂。

**图5。小鼠组织中硫化氢的测定。**
(一)两种野生型小鼠不同组织中的硫化氢浓度(*CSE公司*^+/+)和CSE基因敲除小鼠(*CSE公司*^−/−). (b)使用丙炔甘氨酸（PAG，CSE抑制剂）或氨基氧乙酸（AOA，CBS抑制剂）治疗的野生型小鼠不同组织中的硫化氢浓度。(**c（c）**)使用LC-MS-MS或HPLC-FL方法一次性腹腔注射12.5、25和50μM NaHS溶液后大鼠血浆中的硫化氢浓度。*代表*P（P）* < 0.05; ** 代表*P（P）* < 0.01; ns表示不显著。

**图6。人体血液中硫化氢的测定（n=6）。**
(一)人体血液、血浆和红细胞中的基线硫化氢。(b)用DTT预处理的人血液、血浆和红细胞中的硫化氢水平。(**c（c）**)DTT可降低人体血液、血浆和红细胞中的硫化氢水平。(d日)计算出的硫化氢与使用或不使用DTT测定的人体血液中硫化氢水平之间的比率。(**e（电子）**)DTT预处理前后人血浆中硫化氢的蛋白结合率。(如果)典型的空白减去硫化氢到人类血清蛋白（HSA）的感测图，硫化氢水平在0到10 mM之间(克)典型的空白减去硫化氢到人类血红蛋白（HB）的感测图，硫化氢水平在0至10μM之间。数据表示为平均值±SD，传感器图除外。(小时)空白减去的传感器图(*S公司*)-华法林至人血清蛋白（HSA），硫化氢水平范围为0至64nM。

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1. Reiffenstein R.J.、Hulbert W.C.和Roth S.H.《硫化氢毒理学》。《毒理学年鉴》32、109–134（1992）。-公共医学
1. Abe K.和Kimura H.硫化氢作为内源性神经调节剂的可能作用。《神经科学杂志》16，1066–1071（1996）。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Dello R.C.等人，《硫化氢可以调节下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的证据：大鼠体内外研究》。《神经内分泌杂志》12，225–233（2000）。-公共医学
1. Paul B.D.等人，胱硫醚γ-裂解酶缺乏可介导亨廷顿病的神经变性。《自然》509，96–100（2014）。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Teague B.、Asiedu S.和Moore P.K.《硫化氢在体外的平滑肌松弛作用：控制肠道收缩的生理作用的证据》。英国药理学杂志137，139–145（2002）。-项目管理咨询公司-公共医学

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[2] Reiffenstein R.J.、Hulbert W.C.和Roth S.H.《硫化氢毒理学》。《毒理学年鉴》32、109–134（1992）。-公共医学

[3] Abe K.和Kimura H.硫化氢作为内源性神经调节剂的可能作用。《神经科学杂志》16，1066–1071（1996）。-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Abe K.和Kimura H.硫化氢作为内源性神经调节剂的可能作用。《神经科学杂志》16，1066–1071（1996）。-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Dello R.C.等人，《硫化氢可以调节下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的证据：大鼠体内外研究》。《神经内分泌杂志》12，225–233（2000）。-公共医学

[6] Dello R.C.等人，《硫化氢可以调节下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的证据：大鼠体内外研究》。《神经内分泌杂志》12，225–233（2000）。-公共医学

[7] Paul B.D.等人，胱硫醚γ-裂解酶缺乏可介导亨廷顿病的神经变性。《自然》509，96–100（2014）。-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Paul B.D.等人，胱硫醚γ-裂解酶缺乏可介导亨廷顿病的神经变性。《自然》509，96–100（2014）。-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Teague B.、Asiedu S.和Moore P.K.《硫化氢在体外的平滑肌松弛作用：控制肠道收缩的生理作用的证据》。英国药理学杂志137，139–145（2002）。-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Teague B.、Asiedu S.和Moore P.K.《硫化氢在体外的平滑肌松弛作用：控制肠道收缩的生理作用的证据》。英国药理学杂志137，139–145（2002）。-项目管理咨询公司-公共医学

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