Size-selective opening of the blood-brain barrier by targeting endothelial sphingosine 1-phosphate receptor 1

doi:10.1073/pnas.1618659114

。2017年4月25日；114(17):4531-4536.

doi:10.1073/pnas.1618659114。 Epub 2017年4月10日。

靶向内皮鞘氨醇1-磷酸受体1的血脑屏障选择性开放

附属公司

¹血管生物学项目，波士顿儿童医院，马萨诸塞州波士顿，20115。
²哈佛医学院外科，马萨诸塞州波士顿，20115。
^三纽约州纽约市威尔康奈尔医学院病理学和实验医学系血管生物学中心，邮编：10065。
⁴纽约州纽约市威尔康奈尔医学院菲尔家族大脑和心理研究所，邮编：10065。
⁵波士顿儿童医院血管生物学项目，马萨诸塞州波士顿，20115；timothy.hla@childrens.harvard.edu。

PMID： 28396408
预防性维修识别码：项目经理5410849
内政部： 10.1073/pnas.1618659114

靶向内皮鞘氨醇1-磷酸受体1的血脑屏障选择性开放

柳田圭介等。美国国家科学院程序。 2017。

。2017年4月25日；114(17):4531-4536.

doi:10.1073/pnas.1618659114。 Epub 2017年4月10日。

附属公司

¹2011年，马萨诸塞州波士顿市波士顿儿童医院血管生物学项目。
²哈佛医学院外科，马萨诸塞州波士顿，20115。
^三血管生物学中心，病理学和实验医学系，威尔康奈尔医学院，纽约州10065。
⁴纽约州纽约市威尔康奈尔医学院菲尔家族大脑和心理研究所，邮编：10065。
⁵波士顿儿童医院血管生物学项目，马萨诸塞州波士顿，20115；timothy.hla@childrens.harvard.edu。

PMID： 28396408
预防性维修识别码：项目经理5410849
内政部： 10.1073/pnas.1618659114

摘要

中枢神经系统（CNS）的血管系统形成一种选择性屏障，称为血脑屏障（BBB）。血脑屏障的破坏可能导致各种中枢神经系统疾病。相反，完整的BBB限制了CNS靶向药物的有效渗透。在此，我们报道了内皮鞘氨醇1-磷酸（S1P）受体-1的BBB调节作用，该受体是一种已知的G蛋白偶联受体，可促进外周血管的屏障功能。内皮特异性第1季度基因敲除小鼠(第1季度^iECKO公司)显示小分子质量荧光示踪剂（<3 kDa）的BBB破裂，但较大示踪剂的BBB断裂（>10 kDa。根据新的物体识别测试评估，慢性BBB泄漏与认知障碍相关，但与脑炎症症状无关。脑微血管第1季度^iECKO公司小鼠表现出紧密连接蛋白的亚细胞分布发生改变。S1P的药理抑制₁功能导致瞬时BBB破坏。这些数据表明脑内皮S1P₁通过调节紧密连接蛋白的正确定位来维持BBB，并提高内皮S1P的可能性₁抑制可能是暂时性BBB开放和向中枢神经系统输送小分子的策略。

关键词：血脑屏障；药物传递；内皮；鞘氨醇1-磷酸；紧密连接。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图S1。**
S1P受体、pan-EC、脑EC和NVU细胞的基因表达分析。(A类)主要内皮S1P受体mRNA表达的qPCR分析，*第1季度*,*第1季度第2季度*、和*第三季度*在与对照组隔离的大脑ECs中(*第1季度*^{flox/flox公司})以及*第1季度*^iECKO公司小鼠(n个=1）。(B类)pan-EC标记基因mRNA表达的qPCR分析，*佩卡姆1*和德在大脑皮层和海马中*第1季度*^iECKO公司小鼠(n个= 5). (C类)从全脑分离出的代表性微血管的Brightfield图像。微血管直径为4至15μm。（比例尺：20μm）(D类和E类)脑-EC特异基因mRNA表达的qPCR分析(D类)以及构成NVU的其他单元类型；平滑肌细胞、周细胞、星形胶质细胞和血管周巨噬细胞(E类)来自对照和*第1季度*^iECKO公司小鼠(n个= 4).

**图1。**
示踪剂向大脑的外渗增加*第1季度*^iECKO公司老鼠。*第1季度*在出生后诱导缺失A类–E类在成人中F类. (A类)注射1-kDa Alexa Fluor 555尸体后拍摄的全脑图像。（比例尺：5 mm。）(B类–E类)渗出的1-kDa Alexa Fluor 555尸体碱的定量(B类)，3-kDa右旋糖酐–TMR(C类)，10-kDa右旋糖酐–TMR(D类)和70-kDa右旋糖酐–TMR(E类)在控制中(*第1季度*^{flox/flox公司})以及*第1季度*^iECKO公司小鼠(n个=3或4）。(F类)对照组和对照组中渗出尸体的定量*第1季度*^iECKO公司在成年小鼠中诱导缺失(n个= 3). 数据表示为平均值±SD**P（P）*< 0.05; ***P（P）*<0.01（学生的吨测试）。NS，无显著性。

**图S2。**
*第1季度*^iECKO公司小鼠表现出3-kDa右旋糖酐-TMR示踪剂渗入视网膜的增加。数据表示为平均值±SD。n个= 5. **P（P）*<0.05（学生的吨测试）。

**图2。**
内皮细胞缺失*第1季度*在新生儿期不影响脑血管发育或诱发炎症，但与认知功能障碍有关。(A类)对照组大脑皮层的典型共焦图像(*第1季度*^{flox/flox公司})以及*第1季度*^iECKO公司小鼠用IV型胶原（基底膜）和CD13（周细胞）染色。A类,下部显示高倍放大图像。（比例尺：100μm）(B类)皮质血管密度、分支、直径和周细胞覆盖率的量化(n个= 3). (C类)表达的qPCR分析*伊尔1b*,*伊尔6*、和*Tnfa公司*大脑皮层和海马(n个= 5). (D类和E类)在控制和*第1季度*^iECKO公司出生后开始缺失的小鼠通过NOR任务(D类)或者在成人身上(E类). 新物体的探索时间用新物体和熟悉物体的百分比表示(n个= 11,D类;n个= 7,E类). 数据表示为平均值±SD**P（P）*<0.05（学生的吨测试）。NS，无显著性。

**图S3。**
*第1季度*^iECKO公司小鼠没有血管周围反应性星形胶质细胞增生的迹象。对照组大脑皮层的代表性共焦图像(*第1季度*^{flox/flox公司})以及*第1季度*^iECKO公司显示CD31和GFAP染色的小鼠。（比例尺：200μm）

**图3。**
TJ蛋白在脑微血管中亚细胞分布的改变*第1季度*^iECKO公司老鼠。(A类)TJ蛋白mRNA表达的qPCR分析*氯化物5*,*奥克兰*、和*Tjp1型*和AJ蛋白*加拿大存托凭证5*在对照组的微血管碎片中(*第1季度*^{flox/flox公司})以及*第1季度*^iECKO公司老鼠。相对表达水平归一化为pan-EC标记*佩卡姆1*显示了(n个= 4). (B类)代表性免疫印迹图像(左侧)带量化(赖特)对照组和对照组的TJ蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1和AJ蛋白VE-cadherin第1季度^iECKO公司脑微血管。使用抗CD31抗体作为负荷控制和量化标准化(n个= 3). (C类)对照组和对照组TJ蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1的亚细胞分布*第1季度*^iECKO公司脑微血管(n个= 5). 代表性免疫印迹图像(C类,上部)带量化(C类,下部)如图所示。TJ蛋白在每个组分中的分布占总蛋白的百分比(C类,下部). 数据表示为平均值±SD**P（P）*<0.05（单因素方差分析）。

**图S4。**
TJ蛋白的免疫组织化学分析。(A类)对照组脑毛细血管的典型高分辨率共焦图像(*第1季度*^{flox/flox公司})以及*第1季度*^iECKO公司用谷氨酸1（EC）和TJ蛋白克劳丁-5、闭塞素和ZO-1染色的小鼠。三维重建*z（z）*-给出了堆栈（XY投影或YZ投影）。（比例尺：3μm）(B类)通过Pearson分析量化claudin-5或clodin和ZO-1之间的共定位系数。数据表示为平均值±SD(n个=21-30）。

**图S5。**
内皮细胞缺失*第1季度*不影响CD31和VE-cadherin的亚细胞分布(*第1季度*^{flox/flox公司})以及*第1季度*^iECKO公司脑微血管显示。注意，CD31或VE-cadherin分别只在细胞膜或肌动蛋白细胞骨架部分中检测到。

**图4。**
S1P的药理靶向性₁脑示踪剂外渗增加，具有一定的选择性和可逆性。(A类)S1P的免疫印迹分析₁溶媒或FTY720处理（连续三天5 mg/kg）小鼠的微血管碎片。CD31表达式显示为加载控件。(B类和C类)渗出的1-kDa Alexa Fluor 555尸体碱的定量(B类)和10-kDa右旋糖酐–TMR(C类)车内或FTY720处理的小鼠。(D类)1-kDa Alexa Fluor 555的量化——经载体或FTY720治疗的尸体脑漏*第1季度*^iECKO公司老鼠。(E类)治疗后第7天，对经溶媒或FTY720处理的小鼠体内1-kDa Alexa Fluor 555（尸体）外渗的量化。(F类和*G公司*)在6小时时对经车用或NIBR-0213治疗（30 mg/kg）的小鼠体内溢出的1-kDa Alexa Fluor 555尸体进行定量(F类)或48小时(*G公司*)治疗后。数据表示为平均值±SD。n个=3或4**P（P）*<0.05（学生的吨测试）。NS，无显著性。

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