Improving data quality and preserving HCD-generated reporter ions with EThcD for isobaric tag-based quantitative proteomics and proteome-wide PTM studies

doi:10.1016/j.aca.2017.03.003

.2017年5月22日：968:40-49。

doi:10.1016/j.aca.2017.03.003。 Epub 2017年3月16日。

利用EThcD提高数据质量并保存HCD生成的报告离子，用于基于等压标签的定量蛋白质组学和全蛋白质组PTM研究

青玉¹, 徐东石², 于峰¹, 克雷格·肯特², 李玲君^三

附属公司

¹美国威斯康星大学药学院，威斯康星州麦迪逊53705。
²美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学医学与公共卫生学院外科，邮编53705。
^三威斯康星大学药学院，麦迪逊，威斯康星53705，美国；威斯康星大学化学系，美国威斯康星州麦迪逊53706，电子地址：lingjun.li@wisc.edu。

PMID： 28395773
PMCID公司：第509页第462页
内政部： 2016年10月10日/j.aca.2017.03.003

提高数据质量并使用EThcD保存HCD生成的报告离子，用于等压标记定量蛋白质组学和全蛋白PTM研究

青玉等。 Ana Chim Acta公司. 2017.

.2017年5月22日：968:40-49。

doi:10.1016/j.aca.2017.03.003。 Epub 2017年3月16日。

作者

青玉¹, 徐东石², 于峰¹, 克雷格·肯特², 李玲君^三

附属公司

¹美国威斯康星大学药学院，威斯康星州麦迪逊53705。
²美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学医学与公共卫生学院外科，邮编53705。
^三威斯康星大学药学院，麦迪逊，威斯康星53705，美国；威斯康星大学化学系，美国威斯康星州麦迪逊53706电子地址：lingjun.li@wisc.edu。

PMID： 28395773
PMCID公司：第509页第462页
内政部： 2016年10月10日/j.aca.2017.03.003

摘要

近年来，基于质谱（MS）的等压标记技术由于其高通量定量能力而得到了迅速发展。除了最初设计用于碰撞诱导解离（CID）和高能碰撞解离（HCD）之外，等压标记技术还可以用于电子转移解离（ETD），ETD是CID的补充，在翻译后修饰（PTM）的肽序列测定中是首选。然而，ETD存在反应时间长、占空比降低以及对低电荷态肽的偏见。此外，ETD中常见的碎片机制导致报告离子产生发生改变，复用能力降低，甚至一些等压标签（包括定制的二甲基亮氨酸（DiLeu）标签）的定量能力丧失。在这里，我们展示了一种新的电子转移/高能碰撞解离（EThcD）方法，该方法保留了原始报告离子通道，减轻了对低电荷态的偏见，提高了灵敏度，并显著提高了定量蛋白质组学和全蛋白质组PTM研究的数据质量。进行了系统优化，以实现数据质量和灵敏度之间的平衡。我们将二亮氨酸和TMT标记的HEK细胞裂解物和富含IMAC的磷酸肽与ETD和HCD进行直接比较。结果表明，改进了数据质量和磷酸化定位准确性，同时保留了足够的报告离子生成。通过生物学研究，研究了在四种不同条件下处理的小鼠血管平滑肌细胞系的磷酸化变化。总的来说，与传统ETD相比，EThcD表现出优越的性能，并且在基于等压标记的定量蛋白质组学和定量PTM研究中与HCD相比具有明显的优势。

关键词：二亮氨酸；EThcD；等压标签；翻译后修改；定量蛋白质组学；TMT公司。

PubMed免责声明

数字

图1
二亮氨酸标记肽GEFVTTVQQRGAAVIK的ETD光谱**（A）**并提出了二亮氨酸标记肽的ETD裂解途径**（B）**.星形峰表示ETD生成报告离子损失后的峰值。

图2
二亮氨酸标记肽的荷电状态特异性EThcD反应时间优化。根据反应时间（+2）绘制肽谱匹配（PSM）图（bar）**（A）**, +3（B）, +4（C）和+5（D）)条形图表示重复项±S的平均值。D.平均值±S。来自+2和+3的重复的XCorr中值的D.在相同的图中指示（蓝色实线，右y轴）。计算每个EThcD反应时间+2离子的报告离子强度中位数±四分位范围（IQR）**（E）**.

图3
根据HCD NCE，从二亮氨酸标记的HEK293细胞裂解物胰蛋白酶肽副本中鉴定出的PSM数量**（A）**和EThcD NCE（B）。虽然大多数使用常规HCD的ID的NCE为30，但EThcD需要提升NCE以生成足够的碎片以进行识别。

图4
微软²ETD裂解后的3+肽ADLINNLGTIAK（A）、EThcD（B）或HCD（C）.*表示DiLeu标记的位点，星号峰表示m/z 114的HCD型报告离子。

图5
独特磷酸肽的数量**（A）**.MS软件²所有PSM和磷酸肽PSM的鉴定成功率**（B）**.磷酸肽PSM XCorr值的中位数±IQR（C）.磷酸肽PSM的磷酸RS概率饼图**（D）**.

图6
微软²ETD测定的3+肽ADLINNLGTIAK（A）、EThcD（B）或HCD（C）.*表示TMT标记的位点，星号峰表示HCD型报告离子*米/z*126

图7
四种不同处理的MOVAS细胞系以生物三倍体形式生长。每个复制品用胰蛋白酶消化，用DiLeu标记，分馏，并用EThcD方法分析**（A）**共鉴定出2587个磷酸位点，包括2234个丝氨酸、343个苏氨酸和10个酪氨酸**（B）**2373个磷酸位点被定位，磷化氢RS概率>0.9（C）.

图8
通过CV标准过滤以控制定量准确性后，对照和雷帕霉素处理的两个重复定量结果之间的相关性**（A）**.生物三倍体差异调节磷蛋白的基因本体分析**（B）**HDAC1和HDAC2的磷酸定量**（C）**和SRRM2（D）生物三倍体。所有肽的q值均<0.05。

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