Axonal Endoplasmic Reticulum Ca2+ Content Controls Release Probability in CNS Nerve Terminals

doi:10.1016/j.neuron.2017.01.010

.2017年2月22日；93（4）：867-881.e6。

doi:10.1016/j.neuron.2017.01010。 Epub 2017年2月2日。

轴突内质网钙²⁺CNS神经末梢的内容控制释放概率

Jaime de Juan-Sanz公司¹, 格雷厄姆·T·霍尔特², 埃里克·施赖特², 费尔南多·德胡安^三, 道格拉斯·S·金², 蒂莫西·A·瑞恩⁴

附属公司

¹美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院生物化学系，邮编：10065。
²美国弗吉尼亚州阿什本霍华德休斯医学院Janelia研究院，邮编：20147。
^三牛津大学物理系，牛津，OX1 3NP，英国。
⁴美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院生物化学系，邮编：10065。电子地址：taryan@med.cornell.edu。

PMID： 28162809
预防性维修识别码： PMC5325711
内政部： 2016年10月10日/j.neuron.2017.010

轴突内质网钙²⁺CNS神经末梢的内容控制释放概率

胡安·桑兹监狱等。神经元. 2017.

.2017年2月22日；93（4）：867-881.e6。

doi:10.1016/j.neuron.2017.01010。 Epub 2017年2月2日。

作者

胡安·桑兹监狱¹, 格雷厄姆·T·霍尔特², 埃里克·施赖特², 费尔南多·德胡安^三, 道格拉斯·S·金², 蒂莫西·A·瑞恩⁴

附属公司

¹美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院生物化学系，邮编：10065。
²美国弗吉尼亚州阿什本霍华德·休斯医学院珍妮亚研究院，邮编：20147。
^三牛津大学物理系，牛津，OX1 3NP，英国。
⁴美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院生物化学系，邮编：10065。电子地址：taryan@med.cornell.edu。

PMID： 28162809
预防性维修识别码： PMC5325711
内政部： 2016年10月10日/j.neuron.2017.010

摘要

尽管内质网（ER）延伸至轴突，轴突ER功能障碍与许多神经疾病有关，但其在神经终末的作用尚不清楚。我们开发了新的基因编码的ER靶向低亲和力钙²⁺检测轴突ER-Ca的优化指标²⁺我们的实验表明突触前功能受到ER-Ca的严密控制²⁺内容。我们发现神经元活动驱动净钙²⁺突触前内质网摄取，尽管这种活性对形成胞浆钙没有显著作用²⁺相反，我们发现轴突ER作为质膜（PM）功能的促动器：[Ca²⁺]_急诊室控制突触前终末STIM1的激活，导致突触前功能的局部调节，影响活动驱动的Ca²⁺进入和释放概率。这些实验揭示了突触前内质网在控制神经递质释放中的关键作用，并将有助于未来对内质网驱动的神经元疾病状态的分子基础进行研究。

关键词：钙离子成像；ER-GCaMP；GCaMP6；刺激1；低亲和力钙指示剂；突触前内质网。

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数字

**图1。ER钙²⁺在生理温度下，处理对突触前功能至关重要**
（A-D）单个AP突触前细胞溶质Ca的代表性痕迹²⁺CPA治疗前后使用Fluo-5F AM（A，C）测量的反应和使用vG-pH（B，D）测量的小泡胞吐。实验在37°C（A，B，以红色显示）和26°C（C，D，以蓝色显示）下进行。Fluo-5F AM迹线归一化为CPA前ΔF响应（黑色迹线）。vG-pH响应显示为通过短暂灌注NH获得的最大荧光百分比₄Cl在pH 7.4下缓冲。通过显示CPA治疗后在每种条件（E，F）下的剩余反应来总结观察到的差异效应：Fluo-5F AM，（26°C）n=10，（37°C）n=14***p=1.44·10⁻⁷.vG-pH，（26°C）n=7，（37°C）n=10***p=2.75·10⁻⁴.

**图2。新一代超灵敏ER-Ca²⁺指标**
（A）预测相对荧光与钙²⁺基于获得的绑定参数的曲线*在体外*（表S1）低亲和力钙指示剂GCaMP3-44、GCaMP6-150、GCaMP 6-210和GCaMP3-373（浅绿色到深绿色，高亲和力到低亲和力）和高亲和力细胞溶质指示剂GCa MP3（灰色）和GCaMP 6f（黑色）。Ca的近似范围²⁺胞质溶胶和ER中的浓度由灰色梯度框表示。（B）上图：通过添加钙网蛋白的N端信号肽（CALR信号肽）和C端KDEL保留基序，在神经元内质网表达的靶向方案。底部：体细胞ER-GCaMP6-150的高分辨率图像显示神经元ER结构。比例尺2µM。（C）来自表达ER-GCaMP6-150的神经元的多个场的蒙太奇，该神经元定位于胞体、树突和轴突的ER网络中。比例尺40µM。用500µM离子霉素处理（D-F）神经元，以诱导指示剂饱和以进行校准。（D）离子霉素治疗前后体细胞ER-GCaMP6-150的假彩色图像示例。假彩色标度显示低到高强度。比例尺8µM。（E）荧光平均峰值折叠变化（F_离子霉素/F类₀)在每个ER-GCaMP的离子霉素应用期间。ER-GCaMP3-44，n=14；ER-GCaMP6-150，n=8；ER-GCaMP6-210，n=9；ER-GCaMP3-373，n=8；误差为±S.E.M.（F）pH-根据各指标饱和反应校正的静息内质网钙浓度估计值。虚线表示每个指标估计值的平均值。

**图3。神经活动驱动ER Ca²⁺吸收，吸收**
（A-C）体细胞ER Ca²⁺使用不同指标对20AP（20Hz）刺激的反应。（A） 20AP（20Hz）刺激前后体细胞ER-GCaMP6-150的代表性假彩色图像，以及（B）随时间变化的相应荧光强度（下面的假彩色标度显示从低到高的强度）。比例尺8µM。（C） 20AP体细胞ER-GCaMP反应峰值的平均值：G-CEPIA1er，n=5；ER-GCaMP3-44，n=11；ER-GCaMP6-150，n=12；ER-GCaMP6-210，n=6；ER-GCaMP3-373，n=11；误差为±S.E.M.（D）图，显示轴突内质网穿过神经末梢，其中内质网钙²⁺测量反应。（E）通过VAMP-mCherry表达（左，绿色；刻度条4µM）在静止状态（中间图像）和在20 AP刺激期间识别突触前神经束中的ER-GCaMP-150信号（显示为波形图，右；假彩色刻度显示低到高强度）。比例尺3 s.（F）用ER-GCaMP6-150或细胞溶质GCaMP6-150测量的代表性20AP突触前反应（无ER靶向序列的相同变体）。

**图4。SERCA功能对于活动驱动的ER-Ca是必要的²⁺吸收，吸收**
（A）施用CPA（50µM）5分钟前后，ER-GCaMP6-150至20AP（20Hz）或（B）ER-GCaMP6-210对单个AP刺激的典型突触前反应（分别为黑色和红色）。单个APΔ[Ca的平均值²⁺]_急诊室CPA治疗前的反应为5.9±1.3µM（n=5），CPA治疗后的反应为0.2±0.2µM。（C）方框图显示了在CPA（n=10）、thapsigargin（TG，1µM，n=9）或1,4-二羟基-2,5-二叔丁基苯（BHQ，50µM）治疗5分钟前后用20AP（20Hz）刺激的神经元的平均和单细胞校准峰值响应。

**图5。突触前抑制慢于ER-Ca²⁺SERCA阻断后的耗尽**
（A-C）平均轴突ER Ca²⁺使用ER-GCaMP6-150在26°C（A，蓝色）或37°C（B，红色）下测量动力学。灰色痕迹是单独的实验，尽管一些单独的反应超出了此处使用的刻度，并且它们的峰值未包含在图表中。用20 AP（20 Hz）刺激神经元，然后用CPA处理以诱导ER-Ca²⁺消耗。CPA治疗3分钟后，对第二次刺激的反应消失（第二个箭头，20AP 20Hz）。（C） Δ[Ca的估算²⁺]_急诊室假设平均休息时间²⁺]_急诊室基于离子霉素反应；n（26°C）=8，n（37°C）=15；不超过0.36。（D）单AP细胞溶质钙²⁺在26°C（D、G、蓝色迹线）或37°C（E、H、红色迹线）下进行CPA治疗之前（黑色迹线）和之后，每60s测量一次响应（Fluo-5F AM，归一化为CPA前ΔF响应的平均值）。（G，H）突触前抑制和轴突ER-Ca动力学的比较²⁺消耗。在可能的情况下，将曲线拟合到单指数衰减，并获得时间常数（τ）以进行比较。τ_急诊室（26°C）=47.5±3.4秒，n=8；τ_急诊室（37摄氏度）=26±0.9秒，n=15；τ_细胞钙 ²⁺（37°C）=148±18秒，n=7。

**图6。突触前钙²⁺内流与ER Ca相关²⁺野生型但不在STIM1 KD神经元中的含量**
表达ER-GCaMP6-150和细胞溶质jRCaMP1b的（A-B）神经元与靶向STIM1的shRNA共转染或不转染，并用于检测单个AP驱动的Ca²⁺内流（jRCaMP1b）和轴突[Ca²⁺]_急诊室（ER-GCaMP6-150）。野生型（n=15）和STIM1 KD（n=12）神经元的记录采用[Ca²⁺]_急诊室=25µM，以更好地估计拟合参数（参见方法；无约束数据参见图S6）。这两个变量仅在野生型细胞（A）中相关，并由广义希尔方程（红线）和K很好地描述_1/2105µM±5µM，Hill系数为5.4±2.7（调整后的R平方=0.87）。在STIM1 KD的情况下不可能进行拟合（B，见方法）。灰色和棕色线条表示CPA对钙的预测影响²⁺当[Ca的平均值²⁺]_急诊室（152µM）减少了48µM，这是在SERCA阻断过程中测量到的。

**图7。STIM1调节ER-Ca诱导的突触前功能损伤²⁺耗尽**
（A-D）单个AP驱动的细胞溶质Ca²⁺分别使用GCaMP6f或vG-pH测量信号和胞吐。在野生型神经元、STIM1 KD神经元、表达抗shRNA-resistant版本STIM1（STIM1^重量)或STIM1 KD神经元表达对内质网钙不敏感的抗shRNA型STIM1²⁺EF-hand突变导致的含量（STIM1^EF公司). 在CPA治疗前（黑色）和治疗后（红色）对反应进行量化。黑色虚线表示治疗前的平均反应，而红色虚线表示野生型神经元的量化效应，以便在不同条件下进行比较。（C-D）通过显示CPA治疗后在每种情况下的剩余反应来总结CPA的差异效应。实心黑线表示CPA治疗前的反应，每种情况下标准化为1。（C） CPA对单个AP驱动突触前钙的影响²⁺信号，控制n=16，***p=0.0016；STIM1 KD n=14，n.s.p=0.60；STIM1 KD+STIM1^重量n=10，*p=0.02；STIM1 KD+STIM1^EF公司n=10，n.s.p=0.14。（D） CPA对单个AP vG-pH峰值响应的影响，对照n=10，***p=6.68·10⁻⁵; STIM1 KD n=7，n.s.p=0.22；刺激1 KD+刺激1^重量n=7，*p=0.031；STIM1 KD+STIM1^EF公司n=7，n.s.p=0.55。使用配对样本Student t检验进行统计分析。

**图8。神经末梢局部STIM1富集抑制Ca²⁺流入，流入**
（A）表达STIM1-RFP和突触前标记物突触蛋白-GFP的单个轴突的代表性图像（为了便于观察而拉直）。（B-E）突触蛋白-GFP和STIM1-RFP分别在CPA治疗前（B）和治疗后（C）进行成像。（D-F）在来自8个神经元的218个个体发作中分析了这两种蛋白质的强度谱，并在CPA治疗15分钟前后进行了比较，以获得一维强度互相关谱，表明CPA治疗后STIM1-RFP的突触前富集增加（F；对照=0.66±0.03，CPA=0.75±0.02；**p=0.0012），对突触-GFP的分布影响可忽略不计（对照组，D中的黑色剖面；CPA，E中的蓝色剖面）。（G）单个AP-Ca的平均减少²⁺STIM1-RFP过度表达后的内流。（H）联合转染Phy-GCaMP6（左上）和STIM1-RFP（左下）的神经元的代表性图像，显示对10 AP刺激的反应（左中）。注意，STIM1-RFP丰度较大的神经末梢（1）钙含量较低²⁺STIM1-RFP丰度较低的相邻突触（2,3）的内流（右）（I）H.中所示10AP驱动的phy-GCaMP6信号的量化（J）从10个共同转染的神经元中的564个单个突触获得的单个AP-驱动的phy-GCaMP6信号及其相应的STIM1-RF强度的量化（如H中所示）。STIM1-RFP强度显示为归一化为自荧光的荧光。Phy-GCaMP6反应被分为4个不同的STIM1-RFP强度组（1–1.5、1.5–2.5、2.5–4.5和>4.5），并揭示了STIM1-RF丰度与Ca之间的强烈负相关²⁺大量涌入。

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1. Ariel P、Hoppa MB、Ryan TA。Pv、RRP大小、Ca（2+）通道储备和单个突触束突触前增强的内在变异性。前突触神经科学。2012;4:9.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Armbruster M，Ryan TA。突触囊泡恢复时间是一种细胞范围的而非个体突触特性。自然神经科学。2011;14:824–826.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Beck A、Lohr C、Deitmer JW。单动作电位诱导的水蛭视网膜神经元亚室钙瞬变。神经生物学杂志。2001;48:1–18.-公共医学
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