Colon cancer cell-derived 12(S)-HETE induces the retraction of cancer-associated fibroblast via MLC2, RHO/ROCK and Ca2+ signalling

doi:10.1007/s00018-016-2441-5

.2017年5月；74(10):1907-1921.

doi:10.1007/s00018-016-2441-5。 Epub 2016年12月24日。

结肠癌细胞衍生12（S）-HETE通过MLC2、RHO/ROCK和Ca诱导癌相关成纤维细胞收缩²⁺信号

附属公司

¹维也纳医科大学病理学临床研究所，韦林格·格特尔18-20，1090，维也纳，奥地利。
²奥地利维也纳韦林格街10号维也纳医科大学医学遗传学研究所。
^三奥地利维也纳Althanstrasse 141090维也纳大学生命科学学院临床药学和诊断系。
⁴维也纳医科大学综合癌症中心医学一系，地址：奥地利维也纳韦林格·古特尔18-20号，邮编：1090。
⁵维也纳大学生命科学学院生药学系，奥地利维也纳阿尔坦大街14号，邮编1090。
⁶奥地利维也纳韦林格街13号维也纳医科大学解剖与细胞生物学中心神经肌肉研究部，邮编1090。
⁷奥地利维也纳1090年Borschkegasse 8a维也纳医科大学癌症研究所和综合癌症中心医学一系。
⁸根特大学放射肿瘤学和实验癌症研究系，比利时根特De Pintelaan 185，9000。
⁹维也纳医科大学病理学临床研究所，韦林格·格特尔18-20，1090，维也纳，奥地利。georg.krupitza@meduniwien.ac.at。

PMID： 28013338
预防性维修识别码： PMC5390003项目
内政部： 2007年10月10日/00018-016-2441-5

结肠癌细胞衍生12（S）-HETE通过MLC2、RHO/ROCK和Ca诱导癌相关成纤维细胞收缩²⁺信号

塞雷娜·斯塔德勒等。细胞分子生命科学. 2017年5月.

.2017年5月；74(10):1907-1921.

doi:10.1007/s00018-016-2441-5。 Epub 2016年12月24日。

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¹维也纳医科大学病理学临床研究所，韦林格·格特尔18-20，1090，维也纳，奥地利。
²奥地利维也纳韦林格街10号维也纳医科大学医学遗传学研究所。
^三奥地利维也纳Althanstrasse 141090维也纳大学生命科学学院临床药学和诊断系。
⁴维也纳医科大学综合癌症中心医学一系，地址：奥地利维也纳韦林格·古特尔18-20号，邮编：1090。
⁵维也纳大学生命科学学院生药学系，奥地利维也纳阿尔坦大街14号，邮编1090。
⁶奥地利维也纳韦林格街13号维也纳医科大学解剖与细胞生物学中心神经肌肉研究部，邮编1090。
⁷奥地利维也纳1090年Borschkegasse 8a维也纳医科大学癌症研究所和综合癌症中心医学一系。
⁸根特大学放射肿瘤学和实验癌症研究系，比利时根特De Pintelaan 185，9000。
⁹维也纳医科大学病理学临床研究所，韦林格·格特尔18-20，1090，维也纳，奥地利。georg.krupitza@meduniwien.ac.at。

PMID： 28013338
预防性维修识别码： PMC5390003项目
内政部： 2007年10月10日/00018-016-2441-5

摘要

间充质基质细胞的收缩支持结直肠癌细胞（CRC）向邻近隔室的侵袭。CRC分泌的12（S）-HETE增强癌相关成纤维细胞（CAF）的收缩，因此，12（S”-HETE可能增强CRC的侵袭性。了解转移性CRC的机制对成功干预至关重要。因此，我们研究了基质细胞在由CRC球体、CAF、细胞外基质和内皮细胞组成的生理相关三维体外分析中以及在还原论模型中的促侵入作用。为了阐明CAF如何支持CRC侵袭，肿瘤球体诱导CAF收缩和细胞内游离Ca²⁺测量水平，并对选定的信号级联进行基于药理或siRNA的抑制。CRC球体导致CAF收缩，在相邻的替代基质中产生入口门。负责的触发因子12（S）-HETE激发一个信号，该信号由PLC、IP3、游离细胞内Ca转导²⁺，加利福尼亚州²⁺-钙调素激酶-II、RHO/ROCK和MYLK导致肌球蛋白轻链2的激活，以及随后的CAF迁移。在钙的下游和上游观察到RHO活性²⁺释放。因此，Ca²⁺信号用作中央信号放大器。FDA批准的药物卡马西平、桂利嗪、硝苯地平和盐酸比普利治疗CAF收缩，据报道这些药物会干扰细胞钙的利用率。信号通路的阐明和批准的抑制药物的鉴定保证了针对肿瘤-肿瘤相互作用的干预策略的发展。

关键词：三维入侵模型；花生四烯酸代谢产物；ECM；信号转导；肿瘤进展。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
将CAFs SW620球体中结肠癌球体诱导的CCID形成转移到一细胞追踪器(绿色)染色CT5.3或b条种子密度更高的CT5.3（50%的CT5.3用绿色细胞跟踪器，其他50%用红色电池追踪器）或**c（c）**细胞追踪仪上(绿色)染色的初级CAF3层。通过荧光显微镜在不同时间点监测CCID的形成。通过荧光显微镜在不同时间点监测CCID的形成。展示了至少三个独立实验的代表性图片。d日量化SW620、SW480和LT-97在CT5.3单层中诱导的CCID形成。电子CT5.3细胞、BEC和SW620球体的胶原凝胶培养。细胞追踪器(绿色)染色后的CT5.3细胞包埋在I型胶原凝胶中。然后，cell-tracker(红色)染色的BEC接种在这些凝胶上。随后，将SW620球体置于顶部，并在24小时后通过荧光显微镜监测CCID的形成。未使用SW620球体的培养物作为对照(*小插页*).（f）量化CT5.3和HLF单层中SW620球体诱导的CCID形成。*比例尺*200微米。*条形图*代表平均值，*误差线*表示±SEM，星号与对照组相比的显著性(第页 < 0.05;t吨测试或方差分析）

图2
黄芩素抑制CT5.3和CAF3中CCID的形成，并依赖MLC2。SW620球体用指定浓度的黄芩素或溶剂（对照；DMSO）预处理，并转移到细胞跟踪器上染色一CT5.3或b条CAF3单层。6小时后测量CCID面积。**c（c）**用0.25、0.5、1.0、1.5和2.0µM 12（S）-HETE或溶剂（0）刺激CT5.3细胞20分钟。Western blotting用于测定丝氨酸19的MLC2磷酸化。平均样品装载量由MLC2总蛋白和GAPDH控制。磷脂酶-MLC2（p-MLC2）通过密度计定量，并归一化为MLC2和GAPDH。溶剂处理控制设置为1。d日用非靶向RNA（NTC）或靶向MLC2的siRNA（siMLC2）转染CT5.3细胞。24小时后，SW620球体转移到CT5.3单层的顶部，6小时后，测量共培养CCID面积。电子CT5.3细胞在指定浓度或溶剂对照（对照；DMSO）下预先用布利司他丁处理。然后，将SW620球体放置在CT5.3细胞单层上6小时，并测量CCID面积。*条形图*代表平均值，*误差线*表示±SEM，星号与对照组相比的显著性(第页 < 0.05;t吨测试）

图3
12（S）-HETE诱导Ca的分析²⁺CT5.3细胞中的通路。一CT5.3用2.5μM BAPTA-AM、2.5μM U73122或DMSO预处理，然后用FluoForte™染料培养。然后，用1µM 12（S）-HETE或溶剂（对照；DMSO）刺激细胞，3分钟后测量细胞内游离钙。b条用2.5µM BAPTA-AM或DMSO预处理CT5.3，并用1µM 12（S）-HETE或溶剂（对照；DMSO）刺激。细胞裂解15分钟后，用SDS凝胶电泳分离蛋白质并用Western blotting分析，以测定丝氨酸19处的MLC2磷酸化。平均样品装载量由MLC2总蛋白和GAPDH控制。磷脂酶-MLC2（p-MLC2）通过密度计定量，并归一化为MLC2和GAPDH。溶剂处理对照设置为1。**c（c）**–**（f）**CAFs用细胞内Ca预处理²⁺螯合剂BAPTA-AM、U73122（抑制IP3的生成）和指定浓度的PLC抑制剂edelfosine或DMSO（对照）。然后，将SW620球体放置在CAF单层的顶部6小时，并测量CCID面积。*条形图*代表平均值，*误差线*表示±SEM，星号与对照组相比的显著性(第页 < 0.05;t吨测试或方差分析）

图4
RHO/ROCK信号与CAF收回有关。一用CamK-II抑制剂KN-62以指定浓度或溶剂作为对照（对照；DMSO）对CT5.3进行预处理。随后，将SW620球体放置在成纤维细胞顶部6小时，测量CCID区域。b条用2.5µM ROCK抑制剂Y27632或溶剂预处理细胞，然后用1µM 12（S）-HETE或溶剂（对照；DMSO）刺激15分钟。Western blotting用于测定丝氨酸19的MLC2磷酸化。平均样品装载量由MLC2总蛋白和GAPDH控制。磷脂酶-MLC2（p-MLC2）通过密度计定量，并归一化为MLC2和GAPDH。溶剂处理控制设置为1。**c（c）**–**（f）**用Y27632和RHO抑制剂rhosin预处理CT5.3和CAF3，以指定浓度或溶剂作为对照（对照；DMSO）。随后，将SW620球体放置在成纤维细胞上6小时，测量CCID区域。克用20µM rhosin或DMSO预处理CT5.3，用1µM 12（S）-HETE或溶剂（对照；DMSO）刺激，3分钟后测量细胞内游离钙。小时用20µM rhosin、1µM BAPTA-AM或两者预处理CT5.3细胞，并使用溶剂（DMSO）作为对照（对照）。然后，将SW620球体放置在CT5.3顶部6小时，并测量CCID面积。我,j个用非靶向RNA（NTC）或靶向MYLK的siRNA（siMYLK）转染CT5.3和CAF3。24小时后，SW620球体转移到CT5.3单层的顶部，6小时后，测量共培养CCID面积。*误差线*表示平均值±SEM，星号与对照相比或与括号连接的实验点相比的显著性(第页 < 0.05;t吨测试或方差分析）

图5
抑制细胞内钙²⁺FDA批准的药物的水平增加和CCID形成。一用卡马西平、桂利嗪、硝苯地平、盐酸贝普地尔或二甲基亚砜预处理CT5.3，用1µM 12（S）-HETE或溶剂（对照；二甲基亚砜）刺激，3分钟后测量细胞内游离钙。b条–电子用卡马西平、桂利嗪、硝苯地平和盐酸比普利在指定浓度或溶剂（对照；DMSO）下预处理CT5.3细胞。然后，将SW620球体放置在CT5.3顶部6小时，并测量CCID面积。*条形图*代表平均值，*误差线*表示±SEM，星号与对照组相比的显著性(第页 < 0.05;t吨测试或方差分析）

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